Leber遗传性视神经病变(leber hereditary optic neuropathy, LHON)是一种母系遗传性线粒体疾病，线粒体DNA的突变导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的选择性变性，进而影响病人视觉质量。LHON多见于15~30岁的年轻男性，男女比例为4:1~5:1。已发现超过50种线粒体DNA (mitochondrial DNA,mtDNA)突变与LHON相关，全球约90%的LHON病例与m.11778G>A、m.3460G>A或m.14484T>C引起的mtDNA突变有关，其中m.11778G>A突变自发缓解率最低、预后最差，因此目前基因治疗主要针对m.11778G>A突变位点。m.11778G>A基因突变导致线粒体NADH脱氢酶亚单位4（ND4）功能障碍，线粒体呼吸链的复合体I活性降低，进而使线粒体功能降低并增加了活性氧的产生。RGCs更容易受到线粒体功能障碍的影响，导致细胞凋亡及死亡、视神经变性和视神经萎缩的进一步发展。然而，由于mtDNA突变基因具有不完全外显性，大多数具有LHON相关基因突变的人并无症状，因此对LHON的诊断及治疗仍然充满挑战。
从1988年Wallace等首次发现LHON的线粒体遗传基础开始，近几十年来，随着人们对LHON基因水平的不断研究和深入了解，LHON的基因治疗逐渐投入临床研究，并取得了一定的成果。本文就LHON基因治疗的进展综述如下。
LHON的患者表现为双眼同时或相继出现急性或亚急性无痛性视力丧失。LHON通常包括临床前期、急性期和慢性期三个阶段。LHON在发病初期，一般表现为无明显诱因的单眼逐渐丧失视力、视力模糊，少数患者伴有轻度色觉丧失。当患者视力迅速下降时，即为急性期，同时或连续出现双眼视力丧失的患者分别为25%和75%。患者眼底表现为视网膜充血、发红；视盘边界模糊；视网膜血管扩张、扭曲。LHON患者通常伴有视盘附近视网膜神经纤维层出血和肿胀，大多数LHON患者表现为典型视神经炎样视野损伤，包括中央黑点或中央盲点。急性期过后，LHON患者进入疾病的慢性期，表现为中央视力的静态或永久性丧失，导致严重的视力损害，萎缩期患者还可表现为视神经萎缩，视网膜神经纤维层变薄。尽管LHON通常被认为是非综合征性的，但少数患者仍会表现出神经系统症状，如多发性硬化症样疾病、共济失调和肌张力障碍。
尽管基因治疗技术的发展前景广阔，但如何使目的基因稳定表达仍然是基因治疗技术的难点。mtDNA基因组由16569个双链碱基对和37个与氧化磷酸化相关的多肽编码基因组成。线粒体疾病基因疗法的发展仍面临一些挑战。线粒体是真核细胞中具有独立遗传系统的细胞器，其相对不透水的双层膜结构，通常只允许非常小的分子通过，如ATP和小于10 kDa的蛋白质。这种特殊结构阻止了传统的病毒载体将外源基因转移到线粒体基因组中的途径。Guy等尝试用异位表达技术将正常(野生型)MT-ND4转移到细胞中进行基因治疗并成功表达，为LHON的基因治疗表达提供了理论基础。
异位表达的过程包括将野生型线粒体MT-ND4基因的核编码基因与病毒载体组装、利用病毒载体将重组基因序列传递到细胞核中、正常(野生型) MT-ND4转录并转移到含有突变MT-ND4的患者细胞的线粒体外膜、野生型基因将被编码到功能正常的ND4并导入线粒体以取代突变的ND4，这种替换恢复了蛋白质在细胞呼吸中的生理功能。因此，目前的LHON基因治疗方法依赖于同素异形体表达技术。
目前LHON基因治疗大多采用腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）作为载体。AAV凭借其安全性高、宿主范围广和长期表达的特点成为眼病基因治疗的研究热点，其中AAV2型载体的结构最为明确，更容易在RGC表达。Guy等将核编码的人ND4亚基序列与线粒体靶向序列和FLAG组装成新的重组序列（ND4FLAG），利用AAV2作为载体合成携带野生型ND4基因的重组AAV2（rAAV2-WT-ND4FLAG）。随后，他们向70只小鼠右眼注射rAAV2-WT-ND4FLAG，左眼注射AAV-绿色荧光蛋白作为对照组，结果显示核编码的人ND4复合体I亚基成功导入线粒体且人ND4在小鼠线粒体中的表达不会导致RGCs的减少和图形视网膜电图振幅下降，这表明同种异体ND4基因治疗可能是安全的。Shi等向兔眼玻璃体腔注射了重组AAV2-ND4，结果显示注射后1个月，视网膜神经纤维层平均厚度、视觉诱发电位P100波潜伏期无明显改变。免疫荧光、免疫印迹试验等结果表明ND4基因在视网膜神经纤维层成功表达且无并发症发生。相较于鼠眼，兔眼在体积和形状更接近人的眼睛。以上研究结果提示，通过重组AAV2载体可以有效完成ND4的表达且不会影响原有RGCs的正常生理功能，为人类LHON的基因治疗提供了理论基础。
，重组AAV2载体(“rAAV2-ND4”)在国内首次用于基因治疗临床研究的基因传递。先后有9例患者在2年内完成治疗，在治疗后的3年随访期间，4例患者视力有显著改善，视力改善被定义为最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)提高≥0.3 logMAR，2例患者出现视力波动，即视力变化大于或等于0.3 logMAR。Yuan等在此队列的7年随访研究中报告了8名参与者的数据，8名患者中没有一例发生严重的眼部或全身不良事件，与基线相比，5例患者的 BCVA从0.3 logMAR改善至1.0 logMAR，大多数改善在治疗后3~6个月出现。在本研究中观察到的一个有趣现象是，尽管采用单侧治疗，但治疗者的双侧视力均有所改善，其中治疗眼相较于未治疗眼表现出更大的视力改善。
，Feuer 等的Bascom Palmer眼科研究所研究小组对他们的基因治疗产品(scAAV2-P1ND4v2)进行了一项前瞻性的临床试验。scAAV2 是由分子生物学技术制备的包含自身互补双链的重组AAV，其在细胞中的基因表达更快。他们将28名参与者分为四组，分别给予低、中、高或更高剂量的治疗剂量，每位受试者均行单眼玻璃体注射术。在他们的研究中，所有患者均未观察到与治疗相关的严重不良事件。最常见的不良事件是葡萄膜炎（29%，8/28），严重程度与注射剂量有关，但并未观察到因葡萄膜炎导致的视力下降。值得注意的是，这项研究中包含了慢性（发病>12个月）双眼视力下降患者11例、急性（发病<12 个月）双眼视力下降患者9例 以及单眼视力下降患者8例。在随访36个月时，在双眼视力下降的两组中部分患者BCVA提高>15个字母，但与自然病史队列研究相比，慢性期患者的BCVA在随访36个月时没有明显变化[24]且单眼视力下降组接受治疗后视力并未改善。与前述实验类似，未接受治疗的对侧眼也出现了不同程度的视力提高，但提高程度显著低于治疗眼。研究人员得出的结论是，其基因治疗产品有疗效的可能很小，且与剂量无关。本研究的主要局限性是参与者人数较少，疗效的证明需要更多的参与者。
法国巴黎的GenSight Biologics团队于启动了I /IIa期剂量递增队列研究，并证明了rAAV2/2-ND4 (GS010)的安全性。在此研究之后，团队继续进行了两项3期多中心、随机、双盲对照临床试验，即RESCUE和REVERSE。REVERSE研究纳入了双侧视力丧失持续6~12个月的参与者37名。双侧视力丧失持续≤6个月的参与者被纳入RESCUE试验，共39名参与者。每个受试者的单眼被随机(1:1)分配给rAAV2/2-ND4 (GS010, lenadogene nolparvovec)治疗或假注射治疗。REVERSE研究的参与者双眼在BCVA、对比敏感度和自动视野测量方面均有改善。在第96周，rAAV2/2- ND4治疗后的眼睛最佳矫正视力(BCVA)平均改善0.308 LogMAR (+15 ETDRS字母)。假手术眼平均改善0.259 LogMAR(+13个ETDRS字母)。与基线视力相比，76%的患者视力显著改善。RESCUE 参与者在治疗初期双眼视力逐渐下降，在第24周左右达到最低点，24~48周稳定，48~96周稍有改善，在注射后第96周，与基线相比BCVA提高了0.53 LogMAR，63%的患者视力显著改善。两项研究结果中BCVA变化趋势提示lenadogene nolparvovec对视力改善程度与患者自然病程相关。在急性期患者组中参与者即使接受了治疗，视力仍有下降，结果提示急性进展期的病理变化可能会阻碍rAAV2/2-ND4的表达。
RESTORE是对在RESCUE和REVERSE试验中治疗的受试者进行的长期随访研究，共有 61 名参与者被纳入长期随访研究RESTORE。基于个体BCVA数据散点图(152只眼睛)的LOSS回归模型显示，在之后随访的52个月中受试者BCVA持续改善。这些结果提示，基因治疗的效果可能存在长期性，正常ND4基因的表达具有可持续性。
为研究双眼注射rAAV2/2-ND4对LHON患者的安全性和有效性，Newman等进行了REFLECT研究，该研究包括98名参与者，每名受试者第一只患眼接受rAAV2/2-ND4玻璃体腔注射，第二只患眼接受rAAV2/2ND4或安慰剂玻璃体腔注射。在注射后2年的随访期间，与最低点相比，双眼治疗患者（48例）的平均BCVA分别提高20ETDRS字母和17 ETDRS字母。在单侧治疗患者组中（50例）双眼BCVA均有显著改善，治疗眼和安慰剂眼BCVA分别改善19 ETDRS字母和14 ETDRS字母。实验结果显示双眼注射rAAV2/2-ND4并未增加不良反应的发生率，证明了双眼注射是安全性。此项实验中虽然治疗眼BCVA提高程度大于安慰剂组，但这些差异与注射rAAV2/2-ND4的关系尚不明确，因为在注射安慰剂组中同样观察到BCVA的改善。Carelli等汇总了先前已报道的208 名外部对照组患者，将这些患者的自然病史情况与之前接受治疗的174例LHON患者BCVA比较发现，接受rAAV2/2-ND4注射的治疗眼BCVA明显高于自然病史患者且双侧注射基因治疗可能比单侧注射治疗视力改善更明显。这些结果提示在大样本群体研究中双眼治疗对LHON患者视力改善是安全有效的。由于医学伦理的限制，研究人员收集了外部对照组患者，实验结果可能受人种、年龄及基线资料的影响。与之相反的是，Yang等在其研究中发现1例患者接受双侧基因治疗后视功能减退。该患者在接受双眼基因治疗3个月后，双眼视力、视野、VEP均出现不同程度下降，因此他们不推荐双眼基因治疗。考虑到两个团队基因治疗产品的差异及个体不良反应的异质性，双眼注射基因治疗是否安全仍需更大样本的统计研究。
此外，一些文献表明，年龄和发病时间是视力恢复的重要因素。Wan等发现，年轻患者和发病1~2年内接受治疗的患者视力恢复更好。GenSight Biologics公司的研究也显示，在调整了年龄和随访时间后，末次随访时的BCVA具有统计学和临床意义。这可能与LHON的自然病程及RGCs有关。Zhang等[32]回顾分析了53名接受基因治疗的LHON患者预后因素发现视野指数和基线BCVA与接受基因治疗的 LHON 患者的视力预后呈正相关。这些结果可能为预测LHON患者接受基因治疗的疗效提供依据。
线粒体作为一个相对独立的细胞器系统，由于其独特的双层结构，不受细胞质和其他细胞器的干扰。同时，眼睛的封闭环境和人体的天然屏障功能，为被修饰的目标基因的准确定位和转录提供了强有力的条件。因此，LHON的基因治疗已成为目前最有前途的基因治疗方法。近几十年来，LHON的临床应用从mtDNA突变位点的基础研究到AAV2-ND4在动物实验中的应用，再到近年来人体玻璃体腔注射的安全性和有效性观察，取得了快速发展。
在各个团队进行的多项前瞻性和队列研究中，LHON的基因治疗是安全的，其不良反应不会加重患者的视力丧失，也没有严重的全身不良反应的报道。大多数患者在接受单眼注射后表现出不同程度视力提高，而长期临床观察显示不同个体视力改善程度不同。值得注意的是，单眼注射后双眼视力恢复已被多次报道。一项动物实验研究中结果表明，在一只眼睛中注射AAV2-ND4可改善双眼的视力，这可能是因为两只视神经之间存在一定程度的轴突连通性，这导致两只眼睛都表现出相同视力提高。视力恢复与患者年龄、治疗时间、随访时间有关。但由于样本量小，临床观察时间较短，实验结果的真实性有待进一步验证。此外，LHON是一种复杂的多因素疾病，基因治疗的发展应与其他治疗因素的治疗相结合。
文献来源
刘若武,张晗.Leber遗传性视神经病变的基因治疗进展[J].山东大学耳鼻喉眼学报:1-5.
