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09月14日，北京大学第三医院妇产科生殖医学中心乔杰院士团队在《Clin Transl Med 》杂志发表了题为“The combination of DNA methylome and transcriptome revealed the intergenerational inheritance on the influence of advanced maternal age”的研究文章，通过DNA甲基化测序技术（RRBS）与转录组测序（mRNA-seq）联合，从表观遗传学角度揭示了高龄产妇（advanced maternal age,AMA）相关的DNA甲基化组和转录组的潜在代际遗传。
标题：The combination of DNA methylome and transcriptome revealed the intergenerational inheritance on the influence of advanced maternal age（DNA甲基化组和转录组联合揭示代际遗传对高龄产妇的影响）
发表期刊：Clinical and Translational Medicine
发表日期：09月14日
影响因子：8.554/1区
方法：RRBS、mRNA-seq
摘要：
发达国家和高收入国家中高龄产妇（AMA,≥35岁）分娩的妇女人数在不断增加。大型队列研究表明AMA与各种妊娠并发症和不良妊娠结局的风险增加有关，引起人们对AMA子代长期健康不良影响的极大关注。父母的特定获得特征可以通过某些分子机制传递给子代，但父母与子代AMA相关改变之间的潜在关联在很大程度上仍然未知。
本研究分析了20组家庭（10个AMA和10个Young）的配对父母外周血和脐带血的DNA甲基化，以及10个配对母系外周血和脐带血的对应转录组。研究结果发现，AMA可诱导父母和子代DNA甲基化和基因表达的衰老样改变。SLC28A3等几种基因表达变化与DNA甲基化动态变化高度相关。另外在母系和子代群体中鉴定的AMA相关差异甲基化区域（DMR）在基因组位置和生物学功能方面显著相似，包括神经元分化、代谢和组蛋白修饰通路。母系和子代的共有AMA相关差异表达基因（DEG）在免疫细胞活化和有丝分裂核分裂过程中高度富集。进一步揭示了植入前胚胎发育过程中代际相关DMR的DNA甲基化发育依赖性动态变化，以及在配子发生和早期胚胎发育过程中的代际相关性共有AMA相关DEG（如CD24）的不同基因表达模式。以HTRA3为代表的代际DEG在AMA-MII卵母细胞和胚泡也表现出相同显著变化。
研究结果表明了AMA相关DNA甲基化和转录组的潜在代际遗传，为了解AMA子代的健康问题提供了新见解。
图形摘要
在父母和子代的DNA甲基化组及母系和子代的转录组中鉴定出一系列与母系高龄（AMA）相关的变化。特定的DNA甲基化组和转录组变化呈现出代际相关性。母系和子代群体共有部分AMA相关差异表达基因，如HTRA3，在MII卵母细胞和胚泡中发生显著变化。
研究背景：
目前，关于AMA对孕妇和子代的表观基因组学和转录组学影响研究非常少，关于亲本及子代分子变化具体关系的讨论研究得更少。迄今为止只有三个研究小组分别在新生儿足跟血、脐血和成年女儿的外周血中鉴定出与母系年龄相关的CpG位点。
研究思路：
样本采集和处理
本研究招募了30组有胎儿的家庭（20组亲子家庭和10组母子家庭），根据产妇年龄分为高龄(AMA)组和年轻(Young)组。AMA组产妇平均年龄为39±1.22岁，Young组产妇平均年龄为29.8±2.59岁，AMA和Young组BMI没有显著差异。排除多囊卵巢综合征（PCOS）、糖尿病、高血压、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、系统性红斑狼疮或妊娠并发症（如子痫前期、妊娠期糖尿病、严重代谢综合征或宫内感染）女性；排除早产儿家庭和染色体异常、任何出生缺陷或Apgar评分低于7分的婴儿。所有产妇在足月（37~42周）通过剖腹产分娩。分娩当天采集~4ml脐带血和父母外周血样本并在2小时内处理，分娩前采集父母外周血样本以避免分娩期间输血影响。4 ml样本中，1 ml用于DNA提取，1 ml立即用于RNA提取，其余样本存储在-80°C备用。
研究结果
（1）AMA相关的亲本DNA甲基化异常变化
图1：母系组和父系组中不同的高龄产妇（AMA）相关DNA甲基化变化。
（A） 实验和数据分析流程图。
（B） 四组（AMA母系，Young母系，AMA父系，Young父系）样本的分布三维散点图。200bp片段DNA甲基化模式（n=701937）主成分分析（PCA）的前三个主成分；样本量n=40。
（C） 四组样本DNA甲基化水平分布箱线图。每个点代表每个样品的DNA甲基化水平；AMA和Young组之间的p值由Wilcoxon秩和检验确定。（ns:p>.05）；多组间比较p值由Kruskal-Wallis检验确定。
（D） 所有基因的基因体（Gene body）、转录起始位点（TSS）上游15 kb和转录终止位点（TES）下游15 kb的DNA甲基化水平。
（E） AMA母系组（红色）和Young母系组（蓝色）中特定基因组元件的DNA甲基化水平分布箱线图。每个点代表每个样本的DNA甲基化水平；AMA组和Young组之间的p值通过Wilcoxon秩和检验确定。
（F） 母系组（左）和父系组（右）中AMA相关差异甲基化区域（DMR）的DNA甲基化热图。蓝色表示Young组，红色表示AMA组。橙色表示高DMR，绿色表示低DMR。
（G） 四组重叠和非重叠DMR数量Venn图；左侧显示目标类别中每个DMR的相对基因位置和邻近基因。远端代表远端基因间。
（H）（I） genAge数据库提供的基因与母系组（H）或父系组（I）中AMA-DMR附近的基因之间重叠Venn图。
（2）AMA诱导的子代DNA甲基化变化
图2：高龄产妇（AMA）子代相关DNA甲基化变化。
（A） AMA组和Young组新生儿样本分布三维散点图（样本量：n=20）；200 bp片段DNA甲基化模式的PCA前三个主成分（n=701937）。
（B） AMA和Young组中DNA甲基化水平分布方框图；每个点代表相应样本的DNA甲基化水平；AMA组和Young组之间的p值通过Wilcoxon秩和检验确定。（ns:p>.05）。
（C） 基因体及所有基因的TSS上游15 kb和TES下游15 kb的DNA甲基化水平。
（D）图1E的AMA组（红色）和Young组（蓝色）中特定基因组元件的DNA甲基化水平分布方框图；每个点代表每个样本的DNA甲基化水平；AMA组和Young组之间的p值通过Wilcoxon秩和检验确定。
（E） AMA子代组和Young子代组的AMA相关差异甲基化区域（DMR）DNA甲基化水平热图。蓝色表示Young组，红色表示AMA组。橙色表示高DMR，绿色表示低DMR。
（F） AMA组DMR在不同基因组特征中的比例柱状图。
（G） genAge数据库提供的基因与AMA DMR附近基因的重叠Venn图。
（H） AMA-DMR附近基因与衰老相关分泌表型基因的重叠Venn图。（右）重叠基因对应DMR的相对基因位置和具体基因组坐标。
（I）父系组、母系组和子代组中六个AMA-DMR列表之间的关系UpSet 图。左侧和顶部的条形图表示相应组中的DMR数量。MK-common DMRs是母系和子代群体的共有DMR；FK-common DMRs是指父系和子代群体的共有DMR；FMK-common DMRs是指在母系、父系和子代群体中的共有DMR。
（3）AMA改变了母体和新生儿的转录组
图3：母系和子代中与母亲高龄（AMA）相关的转录改变。
（A-B）母系（A）和子代（B）的AMA组和Young组之间比较的p值和基因表达水平倍数变化火山图。红点和蓝点代表AMA组和Young组之间的上调和下调DEG；浅灰色圆点是指没有显著变化。
（C）母系组和子代组之间重叠或不重叠的AMA-DEG数量（左），母系和子代组中衰老相关分泌表型基因和共有DEG之间的重叠数量（右）Venn图。
（D）C中共有AMA-DEG代表性基因本体（GO）分析气泡图。所有富集条件下的基因数均不少于3个，p<0.05。
（E-G）AMA相关DMR的DNA甲基化水平热图。
（H）四组（AMA子代、Young子代、AMA母系、Young母系）样本SLC28A3基因表达水平。
（I）新生儿样本（左）或母系样本（右）在AMA和Young组中通过qRT-PCR鉴定的SLC28A3相对基因表达水平。每个点代表每个样本的相对基因表达水平；误差线指的是标准偏差。AMA组和Young组之间的p值通过非配对t检验确定(∗p<.05）。
（4）AMA子代的特定变化表现出代际相关性
图4：高龄产妇（AMA）相关DNA甲基化和转录组变化的代际相关性。
（A） qRT-PCR检测新生儿样本或母系样本中AMA和Young组CD24相对基因表达水平柱形图。每个点代表每个样本相对基因表达水平。
（B） qRT-PCR检测的配对母体和新生儿样本CD24相对基因表达水平散点图。
（C） 图2(I)中鉴定的MK-common DMR和FK-common DMR代际和非代际相关差异甲基化区域（DMR）数量，图3(C)中的MK-common DEG代际和非代际关联DEG数量。
（D）（右）每个代际相关DMR早期胚胎发育不同阶段的原始DNA甲基化水平热图。（左）每个代际相关DMR在早期胚胎发育不同阶段的DNA甲基化水平热图和箱线图。每个DMR上游和下游扩增150 bp。仅分析早期胚胎发育的DNA甲基组数据中覆盖三个以上CpG的扩增DMR。每个阶段的红点表示不同DMR的DNA甲基化水平中值。基于甲基化动态模式的K-means聚类DMR。
（E）每个检测到的代际相关DEG在人类卵子发生的不同阶段的基因表达水平热图和箱线图。
（F）每个检测到的代际相关DEG在胚胎发育早期每个细胞中基因表达水平热图。右侧曲线图显示选定六个不同簇中基因的loess平滑行表达动态模式。
图5：母系、子代、MII卵母细胞和胚泡中高龄产妇（AMA）相关转录改变之间的相互关系。
（A）母体血液数据、脐带血数据、一个已公布的MII卵母细胞数据、两个已公布的cry胚泡数据，共五个AMA相关DEG列表的交叉点数Venn。每个数据集中DEG数条形图。
（B） 配对母系和新生儿样本中HTRA3基因表达水平的散点图。
（C）四组（AMA子代、Young子代、AMA母系、Young母系）样本中HTRA3的基因表达。
（D）HTRA3在卵子发生和早期胚胎发育期间的动态基因表达。
（E）qRT-PCR检测的配对母体和新生儿样本HTRA3相对基因表达水平散点图。
（F）qRT PCR检测的AMA和Young组中新生儿样本和母系样本HTRA3相对基因表达水平柱形图。
（G）AMA相关转录组和DNA甲基化组变化的母系和子代之间密切联系的示意图。SLC28A3、CD24和HTRA3三个基因与AMA相关变化分别代表代际相关AMA-DEG的三种典型模式。AMA对孕妇的影响将导致MII卵母细胞或植入前胚胎中特定基因表达（如HTRA3）的异常波动，从而导致在子代中出现类似变化。
（H） AMA、AMA相关的母系分子变化、AMA相关的子代分子变化和疾病风险之间的相互关系示意图。AMA对母体产生不利影响，导致妊娠并发症风险增加。母系变化的可遗传部分，加上父系影响和其他外部因素，导致子代的分子变化异常，从而影响其长期健康。
研究总结
本研究对核心家庭的转录组（mRNA-seq）和DNA甲基化组（RRBS）进行了综合分析，揭示了DNA甲基化组和转录组中AMA相关变化的代际遗传潜在现象。研究表明子代的特定异常变化可能源于AMA对卵母细胞或胚胎的干扰。本研究数据为了解AMA影响的分子机制和解释AMA子代晚年的健康问题提供了宝贵资源和新见解。
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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
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参考文献：
Hua L, et al. The combination of DNA methylome and transcriptome revealed the intergenerational inheritance on the influence of advanced maternal age. Clin Transl Med. Sep;12(9):e990. doi: 10.1002/ctm2.990. PubMed PMID: 36103411.
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