3月25日，百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb，BMS）公司宣布其抗LAG-3单抗relatlimab联合抗PD-1单抗Opdivo（nivolumab）的组合疗法，在评估未经治疗的转移性或不可切除性黑色素瘤患者的II/III期临床试验RELATIVITY-047（CA224-047）中，相比 Opdivo单独用药可显著改善患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS），试验达到主要终点。这是全球首个抗LAG-3抗体的临床III期数据。
该试验采用了随机、双盲设计：一共714位患者以1:1的比例随机分配，分别接受160 mg relatlimab和480 mg Opdivo组合药物，或480 mg Opdivo单独用药。每四周一次静脉注射给药。这次试验的次要终点——总生存期(overall survival，OS）和客观应答率（objective response rate，ORR）还未达到，试验还在进行中。在安全性方面，目前固定剂量的联合疗法耐受性良好，两个给药组中都未出现新的安全信号。
1 LAG-3简介
淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3，LAG-3），又称为CD233，由 Triebel及其同事于1990年发现。LAG-3是一个Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白（Ig）超家族，主要表达在活化T细胞和NK细胞表面。
LAG-3是T细胞的一个抑制性免疫检查点。与PD-1和CTLA-4一样，LAG-3能负向调控T细胞的增殖、激活和稳态。在人CD4+细胞中封闭LAG-3能促进细胞增殖，并提高 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNFα的表达水平。此外，有研究认为LAG-3参与了调节性T细胞（Treg）的抑制性作用[1]。当处于肿瘤环境或慢性感染时，长期的抗原刺激会导致LAG-3持续高表达，引起T细胞耗竭（exhaustion）。因此，阻断LAG-3信号通路能促进耗竭T细胞恢复功能。
此外，与CTLA-4和CD28不一样，研究表明LAG-3可能不是通过与CD4竞争配体MHC II来调控T细胞活性，而是通过其胞内结构域直接向T细胞转导抑制性信号[4]。
2 LAG-3结构
人体中，LAG3基因在第12号染色体上（12p13），与CD4（12p13.31）相近。此外，虽然LAG-3和CD4在蛋白质水平上只有约20%的同源性，它们在蛋白结构上同源性很高。与CD4一样，LAG-3的胞外区也含有4个Ig样结构域（D1-D4），且都在D1和D2之间、D3和D4之间显示出了刚性（rigidity），而在D1-D2和D3-D4之间显示出了相对的灵活性（flexibility）。
LAG-3的胞质尾由三个部分组成：一个丝氨酸磷酸化位点、一个“KIEELE”模体（motif），和一个谷氨酸脯-氨酸二肽重复序列（EP repeat）。其中，“KIEELE”模体高度保守，并可能参与了LAG-3下游抑制信号的转导，因为缺乏该结构的LAG-3蛋白不能发挥对T细胞的抑制作用[2]。
此外，LAG-3还存在可溶性形式（sLAG-3）。sLAG-3可由可变剪接产生，也可由膜结合LAG-3经蛋白质水解切割产生。与膜结合LAG-3一样，sLAG-3可以与MHC II结合，但有研究显示其只会与一小部分抗原呈递细胞（APC）上的脂筏微结构域（lipid raft microdomain）上的MHC II结合[3]。目前关于sLAG-3的具体作用功能还不明确，有研究表明其与树突状细胞（DC）上的MHC II结合能促进DC的成熟和活化。
图1. LAG-3和sLAG-3的结构示意图[4]
3 LAG-3的配体
与CD4一样，LAG-3能与主要组织相容性复合体II类分子（major histocompatibility complex II，MHC II）结合。但相较CD4，LAG-3与MHC II的亲和力更高（约100倍），因为LAG-3可以通过其D1域中一个由30个氨基酸组成的环状结构，增强与MHC II的互相作用[4、5]。研究表明，LAG-3能选择性地与稳定的抗原肽-MHC II分子复合物（pMHC II）结合，因此，LAG-3能优先抑制稳定的pMHCII的CD4+T细胞的活化[8]。此外，MHC II主要表达在APC上，但包括黑色素瘤在内的多种肿瘤细胞也会高表达MHC II，并且这种异常表达与不良预后相关。
另外，有研究表明FGL1（fibrinogen-like protein1）也是LAG-3的主要配体之一[6]。FGL1属于纤维蛋白原蛋白质家族，由肝细胞产生分泌，在多种肿瘤细胞上均有高表达，例如前列腺癌和黑素瘤。
LAG-3还有两个可能的配体LSECtin和Galectin-3，它们可以与LAG-3上的聚糖相互作用。LSECtin属于C-型凝集素，主要在肝脏表达，此外，多种肿瘤细胞会高表达LSECtin，包括黑色素瘤、膀胱癌和胰腺癌。Galectin-3是半乳糖苷粘连蛋白，在多种细胞及恶性肿瘤细胞中均有表达，包括肿瘤微环境中的基质细胞和CD8+ T细胞。
图2. LAG-3的结构及配体[7]
4 总结与展望
LAG-3是一个非常有应用前景的免疫治疗靶点。正如Jonathan Cheng，BMS的高级副总裁所说，“免疫检查点抑制剂的单用或组合用药已经改变（肿瘤）治疗方法，但仍然有相当多的患者可以从利用互补通路来提高抗肿瘤活性的新型联合疗法中受益。”尽管目前已有多款靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗体药物，我们仍然在寻找更多的免疫检查点，研究它们的作用机制，以期开发新型的更有效的免疫疗法。此外，对免疫检查点药物药效机理的研究也至关重要，这有助于提高药物响应率、降低耐药性、改善患者预后。
CTLA-4/LAG3 双免疫检查点人源化小鼠
品系背景：C57BL/6N
品系构建策略：
CTLA-4/LAG3双免疫检查点人源化小鼠模型（hCTLA-4/hLAG3）由hCTLA-4小鼠和hLAG3小鼠杂交得到。hCTLA-4和hLAG3的表达均受内源性小鼠启动子调控。
品系说明：
hCTLA-4和hLAG3在小鼠体内具有正常的生理表达和调节模式。
CTLA-4和LAG3胞外域人源化，利于CTLA-4和hLAG3靶向药物的识别。
保留小鼠CTLA-4和LAG3胞内域，保证正常的胞内信号转导。
小鼠靶基因不表达，避免交叉反应。
小鼠的免疫系统功能健全。
研究应用：
本模型可用于评估hCTLA-4和/或hLAG3靶向药物在免疫健全小鼠体内的有效性及安全性。
模型验证：
1. CTLA-4表达检测
图1. hCTLA-4在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表达模式与mCTLA-4在野生型小鼠中的表达模式一致。
从hCTLA-4/hLAG3小鼠中分离脾细胞，用αCD3/αCD28抗体和mIL-2激活2天（A，B）或指定时间（C，D），检测hCTLA-4和mCTLA-4的表达情况：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）传统CD4+ T细胞（viable, CD3+ CD4+ Foxp3-）；（C，D）CD8+ T细胞（viable, CD3+ CD8+）。
2. LAG3表达检测
图2. hLAG3 在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表达模式。
从hCTLA-4/hLAG3小鼠中分离脾细胞，用αCD3/αCD28抗体和mIL-2激活2天（A，B）或指定时间（C，D），检测hLAG3和mLAG3的表达情况：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）传统CD4+T细胞（viable, CD3+CD4+Foxp3-）；（C，D）CD8+ T细胞（viable, CD3+ CD8+）。
参考文献：
[1] Huang C.T., Workman C.J., Flies D., et al. () Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21(4):503-13.
[2] Shan C, Li X, Zhang J. (). Progress of immune checkpoint LAG-3 in immunotherapy. Oncol Lett. 20(5):207.
[3] Brignone, C., Grygar, C., Marcu, M., et al. (). A soluble form of lymphocyte activation gene-3 (IMP321) induces activation of a large range of human effector cytotoxic cells. J. Immunol. 179, 4202–4211.
[4] Andrews L.P., Marciscano A.E., and Drake C.G., et al. (). LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunological reviews 276,1: 80-96.
[5] Huard B., Mastrangeli R., Prigent P., et al. (1997). Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 27;94(11):5744-9.
[6] Wang J., Sanmamed M.F., Datar I., et al. (). Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3. Cell. 176(1-2):334-347.e12.
[7] Ruffo E., Wu R.C., Bruno T.C.,et al. (). Lymphocyte-activation gene 3 (LAG3): The next immune checkpoint receptor. Semin Immunol. 42:101305.
[8] Maruhashi, T., Okazaki, Im., Sugiura, D. et al. () LAG-3 inhibits the activation of CD4+ T cells that recognize stable pMHCII through its conformation-dependent recognition of pMHCII. Nat Immunol . 19, 1415-1426.]
