通过差异分析，我们可以知道不同分组间是否存在差异，存在差异的是哪些基因。再进一步，需要探究这些基因的表达量出现差异是由哪些生物学过程介导的，我们的实验处理影响了哪些生物学过程。
为了探究上述问题，我们首先需要知道基因参与的生物学过程，这个依赖于我们对生命活动的已有认知，比如常见的KEGG数据库，就存储了基因对应的通路信息。
其次，我们还需要一点统计学手段，差异基因的数目是成百上千的，每个基因又参与多个生物学过程，直接将所有差异基因的功能汇总，会得到非常多的信息，由于数量庞大，所以看起来是杂乱无章的，没有任何规律可言，所以需要借助统计学手段，去挖掘差异基因集中在哪些生物学过程，也就是我们常说的富集分析。
从上面的解释可以看到，富集分析有两个核心
1.基因的注释信息
基因参与的生物学过程，也称之为基因的功能注释，这部分信息主要依赖已有的数据库，常见的数据库包括GO, KEGG, wikipathway, reactome等。
需要注意的是，不同数据库覆盖的基因数目是不一样的，以human为例，一共2万多个蛋白编码基因 ， 其中有KEGG pathway注释的只有6000多个。
由于已有认知的缺陷，这个是无法避免的问题，只能通过不断的探索研究来更新和完善数据库中的内容。
所以在富集分析时，会集合多个数据库来分析，最常见的就是GO和KEGG数据库，近年来reactome用的也越来越多。其实，只要是你感兴趣的功能数据库，都可以拿来做分析。
2. 统计方法
如何研究差异基因集中参与的生物学过程，需要借助统计学手段，常见的方法包括以下两种：
费舍尔精确检验
GSEA
费舍尔精确检验的核心就是得到如下所以的2X2的表格，
DGEGenome
in pathway1940
not in pathway2816800
从两个角度将基因进行分类，是否为差异基因，是否位于待研究的通路上，就可以得到上述表格了。第一列之和为差异基因的总数，第二列之和为非差异基因的总数。
在用这种方式进行分析时，通常会选择一个log2FD的阈值，挑选显著差异的基因，这种一刀切的过滤手段去除了一些可能的关键基因，其次，如果你的差异基因没有对应的pathway注释，那么在富集分析时，会被直接丢掉，以上两点是这种方法的缺陷。
GSEA又称之为基因集富集分析，这里的基因集指的就是数据库中的基因集合，比如pathway中的某条通路对应的所有基因，所以这种方法的研究对象和费舍尔精确检验是一致的。唯一不同的是，它的输入是所有基因，首先对基因进行排序，然后分析排序后的基因列表在某个通路下是否富集。
由于该方法不需要对基因事先过滤，所以不会丢掉某些差异基因，能够挖掘出的信息量也会增加，近年来也是越来越受欢迎。
在后续文章中，会详细介绍不同工具的使用方法。
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