直肠癌术后准确病理分期诊断
对辅助治疗和预后判断的影响
姚宏伟1，李文迪1，田茂霖1，石雪迎2，刘荫华3
1 北京大学第三医院普通外科；
2 北京大学（医学部）病理学系；
3 北京大学第一医院普通外科
中国实用外科杂志 Vol.35 (01):62-65
摘要
准确的病理学检查在直肠癌的诊治流程中发挥着“承前启后”的作用，其既能评判新辅助放化疗及手术切除的效果，又能指导术后辅助治疗，甚至能够用于评判预后的风险程度。TNM分期是直肠癌常规病理诊断的基础，分子病理诊断已经进入临床应用。常用于指导辅助治疗和预后评估的病理学指标包括T分期、N分期、环周切缘、新辅助治疗反应、脉管浸润、神经周围浸润、RAS基因状态、错配修复状态等。
关键词
直肠癌；病理学；辅助治疗；预后评估。
结肠与直肠虽然都起源于胚胎期的中肠和后肠，但其解剖位置、血供、淋巴引流、神经支配与结肠不同。基于其解剖学和生理学的不同，结肠癌与直肠癌的诊治理念和预后也有很大差别：（1）直肠距离肛门较近，且位置相对固定，因此，直肠癌的分期评估手段更多；（2）直肠癌更易侵及盆壁和盆底，且直肠癌手术受限在骨盆的狭小空间内，因此，其复发率更高，预后效果也较结肠癌为差；（3）为获得更高的R0切除率，进展期直肠癌需要行新辅助治疗以降低肿瘤分期抑或瘤体缩小。通过以上简要对比不难发现，直肠癌的手术治疗效果和总体预后均差于结肠癌，故其较结肠癌更加需要精准的肿瘤分期诊断以制定综合诊治策略；另外，直肠癌也较结肠癌更加依赖术前新辅助治疗。一言以蔽之，直肠癌较结肠癌更加需要精准的分期诊断和围手术期综合治疗。
1直肠癌精准病理分期诊断的价值
直肠癌已经进入规范化诊治的时代，肿瘤的基线评估方法、新辅助治疗方案的制定、外科手术切除、手术标本病理评估、术后辅助治疗选择等各个环节均有“标准”可依。纵观直肠癌病人诊治的全过程，有一条“主线”——“肿瘤TNM分期”贯穿始终。精准临床影像学和病理学TNM分期诊断，对于病人选择新辅助治疗、手术切除方法、辅助治疗方案以及预测生存效果等诊治过程中的关键事件均极为重要，并直接影响肿瘤局部复发、病人长期生存等肿瘤学核心关注指标。手术切除标本的病理学检查是直肠癌分期诊断的金标准，其在直肠癌的多学科诊治过程中发挥着“承前启后”的核心作用，它既能评判此前的新辅助治疗以及手术治疗的效果，又能指导术后的辅助治疗，甚至能够评判复发以及预后的风险程度。因此，外科医生掌握并熟练使用病理分期诊断方法，既是自身专业发展的需要更是保证经治直肠癌病人最大获益的根本所在。但完成一份规范、详实的直肠癌病理报告，不仅仅是病理科医师的职责，也需要外科医师的充分了解和密切配合。
传统的直肠癌病理报告仅仅描述肿瘤的“解剖学”特征——直肠癌的浸润深度、检出及转移淋巴结数目、手术切缘情况等。，AJCC恶性肿瘤TNM分期系统更新为第7版［1］，该系统首次使用基于“解剖学分级”和“预后分级”的两套体系：前者根据肿瘤在解剖学上的累及范围，使用T、N、M分期系统进行评定；后者除使用T、N、M分期系统还增加了一些预后因素进行综合评定，例如，结直肠癌的预后因素则包括肿瘤环周切缘、肿瘤沉积、新辅助治疗反应、KRAS基因状态、神经周围浸润、微卫星不稳定等。规范的直肠癌病理诊断报告包括如下指标［2-3］：（1）手术切除范围；（2）肿瘤部位；（3）肿瘤大小；（4）大体类型；（5）切除肠管两端距肿瘤远近端的长度；（6）肿瘤分化程度；（7）T分期；（8）N分期；（9）远近端切缘；（10）环周切缘；（11）新辅助治疗反应；（12）脉管浸润；（13）神经周围浸润；（14）淋巴结外肿瘤沉积；（15）RAS 基因状态；（16）BRAF基因状态；（17）错配修复（mismatch repair，MMR）状态。
2准确病理分期诊断对直肠癌辅助治疗的影响
直肠癌术后辅助化疗的目的是降低局部复发率，降低远处转移率，提高病人的长期存活率。直肠癌手术切除标本的病理学检查能够提供肿瘤局部解剖学的详细特征，指导术后辅助治疗方案的选择。在直肠癌病理报告中，T分期、N分期、环周切缘、RAS基因状态等指标对术后辅助治疗具有重要价值。
2.1 T分期在不同部位直肠癌的评判标准不同
根据与盆底腹膜返折的关系，直肠上、中、下三段分别被划分为腹膜内位、腹膜间位、腹膜外位器官。中下段直肠系膜则不是经典意义的肠系膜，而是包绕肠管侧壁和后壁、横断面为“C”形的柱状结构，由直肠脏层筋膜所覆盖；下段直肠癌远侧位于肛管内，并无直肠系膜及脏层筋膜覆盖，取而代之的是由直肠固有肌层纵行部分向肛侧延续演化而成的内括约肌以及其外侧包绕的外括约肌。上段直肠癌T分期方法与结肠癌无异，而中下段直肠癌的则因其特殊的腹膜被覆、系膜结构以及与骨盆壁、肛周肌肉等解剖结构间的关系，T2-4分期方法需要在第7版TNM分期标准的基础上重新细化定义：（1）肛管内的下段直肠癌，T2期为侵犯内括约肌，而其他部位的中下段T2期直肠癌则为侵犯固有肌层。（2）肛管内的下段直肠癌，T3期为侵及但未侵透外括约肌，而其他部位的中下段T3期直肠癌则为侵及直肠系膜但并未侵达直肠脏层筋膜或浆膜（仅限于中段直肠前壁）。（3）在中下段直肠癌，T4a期仅见于侵透中段直肠前壁的肿瘤，而其他部位的中下段直肠癌因无浆膜被覆则根本不存在T4a期肿瘤；T4b期则为侵透直肠系膜（侵及骨盆壁）的中段直肠癌，以及侵及肛提肌或侵透外括约肌达肛周脂肪的下段直肠癌。
2.2 N分期被细化，但重点仍然在淋巴结检出数目
第7版TNM分期将N1期细化为N1a（仅1枚区域淋巴结转移）、N1b（2~3枚区域淋巴结转移）及N1c（肿瘤沉积），N2分为N2a（4~6枚区域淋巴结转移）和N2b（>6枚区域淋巴结转移）。N分期对于临床分期和制定治疗决策至关重要。因此，尽管病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分期不同均可能影响检出淋巴结数目［4］，但是，NCCN、AJCC仍然建议至少需检出12枚淋巴结。尤其是Ⅱ期结直肠癌（pT3-4N0），如果初始检出淋巴结数目不足12枚，推荐病理医师重新检查大体标本，重新送检更多疑似淋巴结的组织。如果最终检出仍然不足12枚淋巴结，应在病理报告注明确系已尽力检查。对于直肠癌而言，接受新辅助治疗者淋巴结检出数会少于直接手术者。
2.3 环周切缘对辅助治疗和预后判断均有价值
手术切除标本非腹膜覆盖区域的表面，称环周切缘（circumferential resection margins，CRM）。从解剖及组织学角度，在手术切除直肠标本上，从腹膜后或者腹膜外分离下来、无间皮细胞构成浆膜层覆盖的任何层面，都应被视为CRM。中低位直肠切除标本的各个方向（前方、后方、侧方）都涉及CRM问题。福尔马林固定后的手术标本通常较难辨别浆膜覆盖区和非浆膜覆盖区之间的界限。因此，建议外科医生用在标本上作出标记（使用墨汁染色，或者丝线、金属夹标记）以方便病理学评估。对于中低位直肠癌，建议外科医师与病理科医师共同评价直肠系膜切除的完整性及检查环周切缘。
评判肿瘤浸润最深处与CRM之间距离非常必要，CRM不仅是术后选择辅助治疗的重要参考因素［5-6］，也是术后局部复发及长期生存效果的重要预测因子。直肠癌手术切除标本CRM若为阳性，则是术后辅助治疗的必然指征。NCCN指南推荐参照文献［6］美国病理学会《原发结直肠癌病人手术标本检查规范》对直肠癌TME手术标本进行CRM检查，基本要求包括将肿瘤与环周切缘之间的最小距离以mm作为单位记录。CRM阳性定义是“肿瘤距离CRM≤1mm”，而>1mm则视为CRM阴性，肿瘤直接浸润CRM、直肠系膜切除不彻底以及术中肿瘤穿孔等情况均可能造成CRM阳性（图1［6］）。特别指出，“肿瘤”既包括原发肿瘤也包括转移淋巴结内的肿瘤。仅仅是转移淋巴结所致的CRM阳性，病理报告需特殊注明。研究表明，转移淋巴结所致CRM阳性病人的局部复发率低于原发肿瘤直接浸润所致的环周切缘阳性者［5-6］。新辅助治疗后CRM仍为阳性是局部复发更有力的预测指标。
a.CRM 阴性；
b.CRM 阳性：肿瘤生长直接侵及所致；
c.CRM 阳性：直肠系膜切除不彻底所致
图1 直肠癌CRM 示意图（切缘使用墨汁染色）［6］
2.4 RAS 基因状态检测
虽然西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗靶点是EGFR，且在大多数结直肠癌中均可检出EGFR高表达，但研究显示EGFR状态并不能预测EGFR单抗的治疗效果，EGFR的蛋白表达水平并不能作为抗EGFR靶向治疗病人选择的标准，即便是EGFR表达阴性的病人仍可能从抗EGFR靶向治疗中获益［7-8］。NCCN指南不推荐EGFR的常规检测，也不建议根据EGFR的检测结果确定或排除抗EGFR靶向药物治疗。版的NCCN结直肠癌诊疗指南建议［9］，对所有转移性结直肠癌进行RAS突变检测，至少应检测KRAS第2外显子，可能的情况下应该进一步检测KRAS基因的非第2外显子和NRAS基因突变状态，有突变者不宜采用西妥昔单抗或帕尼单抗进行抗EGFR靶向治疗。
3病理诊断对直肠癌预后判断的价值
NCCN指南除了保留原有的“解剖学”病理评价体系外，又全面引入了“预后和预测”评估体系，作为手术后判断肿瘤复发可能性大小以及预测治疗效果和预后的依据，例如环周切缘阳性、脉管浸润、神经周围浸润、新辅助治疗反应差、BRAF基因突变、微卫星稳定等都可以看作是高复发率、预后差的指标，这些指标同样也预示着术后需要更为积极且全面的辅助治疗措施。
3.1 脉管浸润及神经周围浸润与预后相关
淋巴和血行转移是结直肠癌转移的重要途径，脉管浸润（lymphovascular invasion，LVI）是指癌细胞从原发部位脱落进入并浸润淋巴管和静脉血管，LVI是发生淋巴结转移和远处转移的关键步骤。神经周围浸润（perineural invasion，PNI）是指肿瘤细胞包绕神经纤维，并进入神经束膜内沿其扩展的局部浸润现象。
数个多因素分析研究显示，静脉浸润、淋巴管浸润以及神经周围浸润均是结直肠癌病人生存效果差的独立预后因素［10-11］。其中，肠壁外静脉受侵除了是预后差的独立影响因素之外，还是术后肝转移发生的高风险因素［12］，而肠壁内静脉侵犯的预后意义目前尚不明确。
对于Ⅱ期与Ⅲ期结直肠癌，有PNI者生存效果明显差于无PNI者［11，13］。特别指出，Ⅱ期结直肠癌病人术后是否给予辅助化疗一直颇具争议，如何筛选出其中的高危病人是核心内容。PNI、LVI等指标既是预后差的独立影响因素，同时也被视为Ⅱ期结直肠癌病人的高危因素，应视为选择术后辅助治疗的适应证之一［13］。
3.2 新辅助治疗反应
因为直肠癌对新辅助治疗较敏感（发生明显的肿瘤退变反应和降期），因此，术前化放疗引起的病理学变化应该被准确记录，具体标准可以参照美国病理医师学会发布的《原发结直肠癌病人手术标本检查规范》［3］。把新辅助治疗后手术切除的直肠标本进行病理学检查，肿瘤完全退变者预后似乎更好，反之，新辅助治疗无效似乎是预后差的指标之一。因此，凡是接受过新辅助化放疗的病人都需要对手术切除的标本进行全面的检查——原发肿瘤、区域淋巴结、肿瘤周围的卫星结节（或称为肿瘤沉积），以评判肿瘤退变反应程度，因为它与预后具有相关性。经过治疗后，残存肿瘤很少或没有者的预后优于残存肿瘤较多者。
NCCN指南要求报告至少反映“有治疗反应”或“无明显治疗反应”，并推荐选择根据Ryan 等报道改良的“0～3级”肿瘤退变分级（tumor regression grade，TRG）方法［14］。（1）0级（完全反应）：无可见的癌细胞；（2）1级（中度反应）：仅可见单个癌细胞或癌细胞簇；（3）2级（轻度反应）：纤维化反应超过残余肿瘤细胞；（4）3级（无反应）：几乎无纤维化，可见大片癌残留。
3.3 MMR状态检测
MMR基因可修正DNA复制过程中出现的错误以保证DNA 复制的准确性，主要包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等基因。基因组中常存在一些短的串联重复序列称微卫星体（microsatellite，MS），MMR基因功能缺陷常导致MS的长度发生变化，称微卫星体不稳定（microsatellite instable，MSI）。约15%的结直肠癌的发生与MMR基因功能缺陷有关，肿瘤DNA 可检出高频度的MSI（MSI-H）。临床上，MSI-H肿瘤具有右半结肠多见、组织学类型以伴粘液腺癌或低分化腺癌多见等特点［15］。MSI-H肿瘤对以5-FU 为主的化疗不敏感，预后好于微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）肿瘤。因此，NCCN指南建议，对所有TNM-II期肿瘤病人应进行MMR状态检测，以指导治疗和提示预后。
检测肿瘤MMR状态的方法主要有两种：（1）免疫组化法检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等MMR基因蛋白表达状态，如存在任一蛋白失表达即提示肿瘤为MSI-H；（2）基于PCR 法的肿瘤DNA MSI状态检测，可检测美国国立研究院推荐的BAT-26、BAT-25、D5S346、D2S123、D17S250等5个微卫星位点或其他更敏感的单核苷酸位点，如>30%的位点存在不稳定即为MSI-H。
3.4 BRAF基因状态检测
BRAF在结直肠癌中的突变率5%~15%，在MSI-H肿瘤中突变率明显高于MSS肿瘤。绝大多数BRAF突变发生在第15外显子的第600位密码子（V600E）。除极个别病例报道外，BRAFV600E突变与KRAS基因突变通常为排他性。NCCN指南建议对KRAS/NRAS野生型的IV期病人可选择进行BRAF突变检测。尽管BRAF 基因状态对EGFR单抗靶向治疗的预测作用尚存在争议［16-17］，但多数研究认为BRAF突变提示预后不良［16］。
4展望
术前临床分期诊断是科学制定直肠癌初始治疗决策的关键，术后病理分期诊断则成为评价新辅助治疗效果疗效、指导辅助治疗甚至判断预后的依据。因此，不难看出，规范化的病理分期诊断在直肠癌的多学科诊治过程中起到了“承前启后”的核心作用，其既能评判此前的新辅助治疗以及手术治疗的效果，又能指导术后的辅助治疗，甚至能够预测复发以及预后的风险程度。完成一份规范的、能够尽可能多地提供有效信息的病理报告，既是病理医师的职责，也需要外科医师的充分了解和密切配合。
直肠癌已经进入“分子病理诊断”时代，RAS基因、BRAF基因、MMR状态、MSI等分子检测手段已经从实验研究进入了广泛的临床应用，PI3KCA基因、PTEN基因、UGT1A1基因的多态性等分子病理检测项目的临床意义也越来越受到关注。外科医生作为直肠癌诊治临床实践的的启动者和最重要参与者，应该此加以学习和关注，更新诊治理念，以期为直肠肿瘤病人的“个体化”围手术期治疗和判断预后提供进一步的支持。
参 考 文 献［1］ Edge SB, Byrd DR, Compton CC, et al. AJCC Cancer Staging Manual［M］.7th Edition. Springer,.［2］ 卫生部医政司，结直肠癌诊疗规范专家工作组. 结直肠癌诊疗规范（ 年版）［J］. 中华胃肠外科杂志, , 13(11):865-875.［3］ Washington MK, Berlin J, Branton P, et al. Protocol for the examination of specimens from patients with primary carcinomas of the colon and rectum［J］. Arch Pathol Lab Med, , 133(10):1539-1551［4］ Sarli L, Bader G, Iusco D, et al. Number of lymph nodes examined and prognosis of TNM stage II colorectal cancer［J］. Eur J Cancer, , 41(2):272-279.［5］ Nagtegaal ID, Marijnen CA, Kranenbarg EK, et al. Circumferential margin involvement is still an important predictor of local recurrence in rectal carcinoma: not one millimeter but two millimeters is the limi［t J］.Am J Surg Pathol, 2002, 26(3):350-357.［6］ Nagtegaal ID, Quirke P. What is the role for the circumferential margin in the modern treatment of rectal cancer?［J］.J Clin Oncol,, 26(2): 303-312.［7］ Cunningham D, Humblet Y, Siena S, et al. Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer［J］. N Engl J Med, , 351(4):337-345.［8］ Chung KY, Shia J, Kemeng NE, et al. Cetuximab shows activity in colorectal cancer patients with tumors that do not express the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry［J］. J Clin Oncol, , 23(9):1803-1810.［9］ /professionals/physician_gls/pdf/rectal.pdf（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: rectal cancer V.3.）［10］ Compton CC. Colorectal cancer［M］. In: Gospodarowicz MK,O"Sullivan B, Sobin LH, et al. Prognostic Factors in Cancer.New York: Wiley-Liss, :133-137.［11］ Fujita S, Shimoda T, Yoshimura K, et al. Prospective evaluation of prognostic factors in patients with colorectal cancer undergoing curative resection［J］. J Surg Oncol, , 84(3):127-131.［12］ Blenkinsopp WK, Stewart-Brown S, Blesovsky L, et al. Histopathology reporting in large bowel cancer［J］. J Clin Pathol,1981, 34(5):509-513.［13］ Quah HM, Chou JF, Gonen M, et al. Identification of patients with high-risk stage II colon cancer for adjuvant therapy［J］.Dis Colon Rectum, , 51(5):503-507,［14］ Ryan R, Gibbons D, Hyland JMP, et al. Pathological response following long-course neoadjuvant chemoradiotherapy for locally advanced rectal cancer［J］. Histopathology, , 47(2):141-146.［15］ Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. Colorectal cancer［J］.Lancet, , 375(9719):1030-1047［16］ Douillard JY1, Oliner KS, Siena S, et al. Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer［J］. N Engl J Med, , 369(11):1023-1034.［17］ Maughan TS1, Adams RA, Smith CG, et al. Addition of cetuximab to oxaliplatin-based first-line combination chemotherapy for treatment of advanced colorectal cancer: results of the randomised phase 3 MRC COIN trial［J］. Lancet, , 377(9783):2103-.
（-10-25 收稿）
