摘 要：目的构建疏风解毒胶囊抗炎作用谱效关系网络模型，探究其发挥抗炎作用的潜在物质基础。方法 在建立疏风解毒胶囊不同配比样品指纹图谱分析方法的基础上，采用均匀设计法对疏风解毒胶囊中8味药材随机采样得到不同配比组，测定各配比样品对脂多糖（LPS）诱导的RAW264. 7细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-6）的抑制率，将药效信息与各样品MS指纹图谱化学信息用BP人工神经网络分析得出各色谱峰对抗炎活性的影响程度，建立谱效关系。结果 通过建立的最佳神经网络模型，计算得到14个特征峰与疏风解毒胶囊抗炎活性显着相关。结论 通过谱效研究，推测疏风解毒胶囊发挥抗炎作用的药效物质基础可能为包括大黄酸、大黄素、马鞭草苷、毛蕊花糖苷、松脂素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、虎杖苷等在内的14个化合物。
中药复方化学成分复杂，这些复杂的化学成分之间相互配伍，从而发挥中药复方的治疗效果，因此研究中药复方的化学成分与药效之间的关系就显得尤为重要[1]。近年来，中药谱效关系研究快速发展，它将中药指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行关联，建立了以化学分析与生物活性评价相结合的综合评价体系，为揭示中药方剂中的药效物质基础和配伍规律提供了有效手段[2]。本实验在建立疏风解毒胶囊不同配比样品LC-MS分析方法的基础上，通过均匀设计方法对疏风解毒胶囊中8味药材（虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草）随机采样成不同比例组后提取，并进行体外抗炎活性实验研究，采用综合评分法对2个考察指标进一步数学处理，使其更科学化，最后利用Matlab编程，采用人工神经网络算法对药效学信息与各组MS指纹谱化学信息进行相关性分析，得出与抗炎活性密切相关的化学成分，初步阐释疏风解毒胶囊的潜在抗炎药效物质基础。
1材料
1.1仪器
酶标仪（德国Berthold公司）；Acquity UPLC、Premier质谱仪（美国Waters公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2细胞培养箱、倒置显微镜（日本Olympus公司）；AB204-N电子天平（德国Mettler公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海之信仪器有限公司）；离心机（德国Hettich公司）。
1.2试剂与药材
小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、小鼠白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）；地塞米松、脂多糖（LPS）、DMSO（美国Sigma公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、双抗（美国Gibco公司）；乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
虎杖、连翘、板蓝根、马鞭草、败酱草、柴胡、芦根、甘草由安徽济人药业有限公司提供，经天津药物研究院张铁军研究员鉴定，各药材均符合《中国药典》版相关标准，相关药材保存于天津药物研究院中药和健康产品研究中心药材库。
1.3细胞
小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用DMEM高糖完全培养基（含1%双抗和20%胎牛血清）培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱。
2方法与结果
2.1供试样品制备
均匀设计法（uniform design，UD）是只考虑试验点在试验范围内均匀散布的一种试验设计方法，不带有随机性且实验水平数较多，能探索较大的剂量范围[3]。采用DPS软件对药材进行8因素21水平均匀设计，各药材按处方最大量2倍设计：虎杖0～900 g，板蓝根、连翘、柴胡、败酱草、马鞭草0～720 g，芦根0～540 g，甘草0～360 g，N0号按处方原配比设计，结果见表1。
根据均匀设计表的配比，按照疏风解毒胶囊原制备工艺，制得22个样品的冻干粉，取双份精密称定后，其中1份加入70%乙醇配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液，离心取上清，即得LC-MS实验的供试品溶液。另1份加DMSO制备成200 mg/mL的储备液（于−20 ℃保存），用于细胞实验。
2.2样品LC-MS分析
色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸超纯水溶液（B），梯度洗脱程序：0～2min，2% A；2～6 min，2%～12% A；6～15 min，12%A；15～20min，12%～20%A；20～37min，20%～50%A；37～40min，50%～100%A；体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，样品室温度25 ℃；进样量10 μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；V模式；毛细管电压3.0 kV（正离子模式）/2.5 kV（负离子模式），锥孔电压30 V；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂氮气体积流量600 L/h；锥孔气体积流量50 L/h；检测器电压1900 V（正离子模式）/2 000 V（负离子模式）；采样频率0.1 s，间隔0.02 s；质量数检测范围m/z 100～1 500；内参校准液采用亮氨酸脑啡肽醋酸盐（[M＋H]+＝555.293 1，[M－H]−＝553.2775）。
为了获得良好的谱图效果，本研究对LC-MS检测条件进行了优化，包括进样量选择、流动相梯度考察等，最终确定了以上实验条件。取N0样品进行了方法学考察，结果表明，精密度试验（n＝6）、稳定性试验（24 h内，n＝6）、重复性试验（n＝6）均良好，RSD均不超过5%，表明检测方法可行。
通过UPLC-Q/TOF MS分析，得到了N0～N21号样品的正、负离子模式BPI图（图1）。采用Waters公司的MassLynx4.1软件中Markerlynx模块进行色谱峰自动识别和峰匹配，将22个样品质谱信息导入Markerlynx进行主成分分析（PCA）得到Score图和Loading图（图2），通过Score图可以看出22个样品的分散度较大，说明样品间差异较大。分析Loading图和Marker数据表选取了贡献（significance）值较大的44个marker色谱峰进行整合，建立22个样品的LC-MS谱库。
2.3体外药效实验研究
取生长至80%～90%的RAW264.7细胞，调整细胞密度为2×105个均匀接种于96孔板，于37.5 ℃、5% CO2培养箱培养过夜后吸去上清，按实验分组，每组设6个复孔，对照组（C）每孔加入100 μL含2%血清的DMEM，模型组（M）加入100 μL终质量浓度为0.1 μg/mL的LPS，阳性药组（D）加入100 μL终浓度为0.1 mmol/L地塞米松和0.1 μg/mL的LPS混合溶液，N0～N21给药组中每孔加入100 μL终质量浓度为500 μg/mL的供试样品及0.1 μg/mL的LPS混合溶液。各组细胞处理后，置于37.5 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，收集细胞上清液，用酶联免疫吸附试剂盒进行TNF-α、IL-6的含量测定（结果见图3、4）。从结果可以看出，不同配比的疏风解毒样品对炎症因子的抑制效果有较明显的差异。
2.4综合指标的计算
TNF-α、IL-6是活化的单核、巨噬细胞产生的炎症细胞因子，在众多炎症细胞因子中，起主要作用。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。以TNF-α、IL-6抑制率为指标进行综合评价，总分为100分，TNF-α、IL-6抑制率各占50分。以各指标的最大值为最高分，以此类推（如IL-6抑制率最大值为76.46%，评分为50分，其余各组的评分Yi,IL-6＝50×Xi,IL-6/76.46，Yi,IL-6指各样品IL-6指标的得分值，Xi,IL-6为各样品的IL-6抑制率），结果见表2。
2.5BP神经网络建模及预测
采用BP（back propagation）神经网络算法进行疏风解毒胶囊体外抗炎实验的谱效相关性分析，采用MATLAB编程，BP网络参数如下[4]：①网络层数为1个隐含层；②输入层的节点数为44，即22个样品的44个特征峰；③输出层的节点数为1，即抗炎综合药效；④隐含层的节点数在公式n=log2m（n为隐含层神经元个数，m为自变量个数）的基础上，通过反复试验优化，最终确定为6；⑤传输函数：隐含层传递函数选择双曲正切函数（tansig），输出层传递函数选择线性函数（purelin）；⑥训练函数经反复试验选为trainlm；⑦训练次数为1 000次，训练精确度为0.01。为使网络更好地收敛，实验数据在输入前应用规格化函数Ai＝Ai/Amax进行处理，使所有输入、输出样本规范到 [0，1] 的范围内。利用结合遗传算法（geneticalgorithm，GA）确立的最优GA-BP模型计算44个特征峰与抗炎药效的关联关系。结果显示，前14个正相关的色谱峰（峰号为43、6、35、32、30、26、16、15、42、23、8、14、11、4）MIV值均大于0.01，与抗炎功效关系密切，可能为疏风解毒胶囊发挥抗炎作用的潜在物质基础。经鉴定分别为大黄素、马鞭草苷、羟基甘草酸、甘草素、大黄酸、决明酮-8-O-葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、松脂素-β-D-葡萄糖苷、柴胡皂苷D、芹糖基-异甘草苷、反式-虎杖苷、连翘酯苷A、异甘草苷、连翘酯苷E，具体信息见表3。
3讨论
炎症是许多不同类型疾病共同的病理基础。疏风解毒胶囊所治疗的病症“风热证”，多见于风热之邪侵袭卫表，导致肺卫不宜。其病因病机相当于现代医学的上呼吸道感染，上呼吸道感染通常是由病毒和细菌等病原体入侵导致炎症因子过度释放引起呼吸道黏膜急性炎症[5]，症见发热、恶风、咽痛、头痛、鼻塞、流浊涕、咳嗽等，其主要相关症状与风热证主要症状，即“风热上扰，咽喉不利，故咽喉肿痛；风热袭肺，肺失清肃，肺气上逆，故咳嗽；肺气失宣，鼻窍不利，津液为热邪所灼，故鼻塞流浊涕；风热袭表，卫气抗邪，阳气浮郁于表，故有发热。”一致，均属炎症症状。前期研究表明疏风解毒胶囊对大鼠肺炎模型具有抗炎作用[6]，本实验利用LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7体外炎症模型，通过测定细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量变化，评价疏风解毒不同配比样品的抗炎效果，进一步结合各样品MS指纹图谱化学信息利用BP人工神经网络分析得出各色谱峰对抗炎活性的影响程度，建立谱效关系，找到潜在的抗炎药效物质基础。
本实验计算出的14个关键化合物的主要结构类型为：环烯醚萜类（马鞭草苷）、蒽醌类（大黄素、大黄酸）、苯乙醇苷类（连翘酯苷A、连翘酯苷E、毛蕊花糖苷）、二苯乙烯类（反式-虎杖苷）、木脂素类（松脂素-β-D-葡萄糖苷）、黄酮类（甘草素、异甘草苷、芹糖基-异甘草苷）、三萜皂苷类（羟基甘草酸、柴胡皂苷A）及蒽酮类（决明酮-8-O-葡萄糖苷），大量研究已证明各类成分均有一定的抗炎特性。Vareed等[7]发现，马鞭草苷可抑制花生四烯酸代谢途径中起关键作用的环加氧酶（COX-1和COX-2）的活性，发挥抗炎效果。杨文修等[8]揭示了大黄素、大黄酸和大黄酚等蒽醌类成分均可不同程度地抑制激活炎性介质释放的蛋白酪氨酸激酶（PTK）、蛋白激酶C（PKC）、钙调素蛋白激酶（CaMPKs）等胞内激酶的活性，发挥抗炎作用。苯乙醇苷类化合物连翘酯苷A在LPS诱导的体外BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞炎症模型中可抑制核转录因子-κB（NF-κB）信号通路和提升核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶1（HO-1）的表达水平[9]，毛蕊花糖苷能减少超氧化物自由基的产生，从而降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活性[10]，二者都表现出抗炎活性。Huang等[11]研究发现，虎杖苷可通过下调Toll样受体4（TLR4）和NF-κB来抑制促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的释放。体外实验表明，连翘中的木脂素类及其苷均可抑制cAMP磷酸二酯酶活性，升高炎症细胞cAMP水平从而发挥抗炎的作用[12]。另有文献表明[13]，甘草抗炎的主要成分包括黄酮类成分，其可通过抑制淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润和TNF-α、IL-1β等炎症介质释放从而减少中性粒细胞募集，有效的对抗炎症反应，其中甘草素可抑制卵白蛋白致哮喘小鼠免疫IgE抗体的产生[14]，异甘草苷可抑制炎症因子前列腺素E2（PGE2）和NO的生成[15]；同时，甘草中的三萜皂苷类成分亦能通过调节巨噬细胞产生NO、TNF-α及IL-1等炎症因子并抑制磷脂酶A2（PLA2）酶的活性及COX-2的表达而降低PGE2的合成来发挥抗炎作用[16]。综合以上研究报道，部分印证了本研究的谱效预测结果，因此推测，实验辨别出的14个化合物可能是疏风解毒胶囊发挥抗炎作用的有效成分，为疏风解毒胶囊质量控制标准的建立和进一步确定药效物质基础提供参考。
参考文献（略）
来 源：韩彦琪，曹 勇，董亚楠，李翔宇，武 琦，许 浚，龚苏晓，张洪兵，翟永林，张铁军，刘昌孝. 基于神经网络分析的疏风解毒胶囊抗炎作用谱效关系研究 [J]. 中草药, , 50(15):3526-3533.
