人类免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒
【生产厂家】深圳市匹基生物工程有限公司
【批准文号】国药准字S2001
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】24tests/盒
【医保类型】
【国家基本药物】否
【正文】
人类免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒使用说明书
Operation Introduction for Quantitative Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) PCR Fluorogence Diagnostic Kit
前言:
本试剂盒利用一对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的特异性引物、一个特异性荧光探针，采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，并应用RT-PCR技术实现对HIV-1 RNA gag基因区域的扩增。选取的靶区域是gag基因区域中部的一段保守区，长度102bp。gag基因位于HIV-1基因组的5’端约790—2292nt处，编码核衣壳蛋白等结构蛋白。试剂盒同时利用荧光探针(Taqman探针和杂交双探针)检测技术，该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合，随着PCR过程的进行，荧光信号发生相应的变化，使用在线监测的荧光PCR检测仪，即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测。本试剂盒还应用了竞争性内标技术，该内标与靶序列共用一对引物，而只在探针结合部位与靶序列有所不同。这种在提取、逆转录以及PCR扩增效率方面均与待检测样本核酸片段相同的竞争性内标的加入，即可实现对待检测样本RNA的提取和逆转录等过程的全程监控，还可以监控PCR反应的进程，对样本中影响PCR反应体系的各种因素进行修正，从而实现对血浆样本中HIV-1 RNA的定量检测。本试剂盒还对引物和探针进行了优化，使得对HIV-1 B,B’,C,E等中国主要流行亚型有相似的扩增效率。
本品用于人血浆样本中的HIV-1 RNA的定量测定，适用于HIV感染的辅助诊断，抗HIV-1药物治疗的效果的检测。
抗病毒药物的疗效评价主要直接依赖两个指标:血浆中HIV RNA滴度和CD4+细胞数。在抗病毒药物治疗的跟踪中，本试剂盒可定量测定血浆中HIV RNA滴度，动态地反映治疗中HIV RNA滴度的变化，为疗效评价提供指标。
当前对HIV/AIDS的诊断主要依靠实验室检测，即HIV抗体检测。抗体检测很大程度上降低了HIV经血传播的危险性，但由于窗口期的存在，仍然不能完全避免。P24抗原检测可将“窗口期”缩短5-6天，但其在外周血中的存在时间非常短。而核酸检测方法可将“窗口期”缩短10-15天，更进一步降低了HIV经血传播的危险性。HIV核酸检测的对象还包括HIV阳性母体所生的婴儿、阳性患者的性伴侣、静脉吸毒者和可疑的血清反应者。
试剂盒原理
RT-PCR
本试剂盒利用一对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的特异性引物，采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，应用RT-PCR首先对HIV-1 RNA上的靶序列实现逆转录生成 cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增。
FQ-PCR
采用FQ-PCR对前期RT-PCR产物进行扩增。FQ-PCR采用荧光探针(Taqman探针或杂交双探针)检测技术，除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5"端标记一个荧光基团，3"标记另一个荧光基团。此时5"端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团，因此正常情况下检测不到该探针5"端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；Taq酶的5"—3’外切酶活性将探针5"端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。使用在线监测的荧光PCR检测仪监测PCR过程中的荧光信号，即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测。
扩增靶序列
选取的靶区域是HIV gag基因区域中部的一段保守区，长度102bp。gag基因位于HIV-1基因组的5’端约790—2292nt处，编码核衣壳蛋白等结构蛋白。本试剂盒还对引物和探针进行了优化，使得对HIV-1 B，B’,C,E等中国主要流行亚型有相似的扩增效率。
竞争性内标
本试剂盒包含有一个竞争性内标，该体外合成的内标与靶序列共用一对引物，而只在探针结合部位与靶序列有所不同。这种在提取、逆转录以及PCR扩增效率方面均与待检测样本核酸片段相同的竞争性内标的加入，即可实现对待检测样本RNA的提取和逆转录等过程的全程监控，还可以监控PCR反应的进程，对样本中影响PCR反应体系的各种因素进行修正，从而实现对血浆样本中HIV-1 RNA的定量测定。
防污染扩增
本试剂盒采用尿嘧啶糖基酶(UNG)—dUTP系统对临床样本中的靶序列实现选择性扩增，从而达到对扩增产物的预防污染。UNG可识别并裂解掺入U的DNA链，但对含T的DNA却不能起作用。扩增体系中用dUTP代替dTTP后，造成扩增产物均为含U的DNA链，而自然界的DNA均为含T的。因此体系中UNG在扩增之前选择性地裂解含U的扩增产物，使其无法随后被体系扩增，而自然存在的靶DNA仍然正常进行扩增。
试剂盒规格:24tests/盒
试剂盒组成
*)校准品具体拷贝数请参照校准品包装盒内给定值
试剂盒储存条件及有效期
裂解液应为红色液体，置4℃保存；
RT-PCR酶应为白色圆形颗粒，在室温条件下置于干燥器内保存；使用前请注意观察是否发生潮解:颜色变为部分或全部透明，形状变小或变为不规则，或完全蒸发，一旦潮解应弃用；
Taq酶和UNG均应为无色透明液体，置–20℃保存；
其他试剂均应目测为无色透明液体，置–20℃保存，不宜反复冻融。使用前应在室温下完全融化，并充分振荡混匀后稍事离心；
所有试剂避光保存；
所有试剂有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备物品
自备试剂(分析纯)
自备仪器
PCR前准备区:小型离心机
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
一次性耗材（吸头、离心管、手套、帽子等）
专用工作服、工作鞋、办公用品
样本处理区:高速冷冻离心机
PCR扩增仪
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
一次性耗材（吸头、离心管、手套、帽子等）
专用工作服、工作鞋、办公用品
检测区:小型离心机
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
荧光PCR检测仪
一次性耗材（吸头、离心管、手套、帽子等）
专用工作服、工作鞋、办公用品
建议使用离心管和吸头一览表
样本采集、存放及运输
本试剂盒仅适用于血浆样本。采集的全血用EDTA抗凝，肝素（Heparin）对PCR抑制，不能使用。
1．样本采集:用无菌注射针头采2ml静脉血于含有抗凝剂的无菌离心管中，室温放置不应超过4hr，室温1600g离心20min，分离血浆转入无菌Eppendorf管中备用。
2．存放:分离后的血浆标本在2℃—8℃条件下保存应不超过5天；放置于-70℃条件下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
3．运输:血浆标本应在2℃—8℃或冷冻条件下进行运输。
适用仪器
1．PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪
2．Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪
3．Roche LightCycler荧光PCR检测仪
4．其他单通道荧光PCR检测仪可以不使用内标实现对HIV-1 RNA的检测。
使用方法（使用前请仔细阅读本说明书）
1．样本处理（样本处理区）
所有试剂、样本使用前置室温解冻。
1.1．使用裂解液的样本处理操作流程
1.1.1.配制裂解液的工作液
首先计算所需裂解液的份数n（n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照），按（n+1）×150ul的量取出裂解液加入适当体积反应管中，在其中按（n+1）×2ul的量加入内标，颠倒混匀10-15次，即成裂解液的工作液。该工作液当天用完，否则应盖严管盖密封后丢弃。
1.1.2.取n个0.5ml的灭菌离心管，作好标记。
1.1.3.在上述每一个管中加入150ul裂解液的工作液，然后加入待测样本和阴性对照50ul，2个阳性对照品管中各先分别加入阳性对照25ul，然后加入阴性对照25ul(切不可将二者混合后加入)，用吸头反复吸打混匀（一份样本换用一个吸头）；再加入50ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次（不宜过于强烈，以免产生乳化层）。
1.1.4.离心（13000rpm，15min）。
1.1.5.取与步骤1.1.2.中相同数量的0.5ml灭菌离心管，各加入100ul异丙醇和2ul RNasin，作好标记。吸取步骤1.1.4.各管中的上层液相转移至相应的管中（注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质），颠倒混匀。
1.1.6.离心（13000rpm，15min，注意固定离心管方向）。轻轻吸出上清；加入300ul 75%乙醇，颠倒洗涤。
1.1.7.离心（13000rpm，10min，注意固定离心管方向）。轻轻吸出上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。
1.1.8.离心（2000rpm，5sec，注意固定离心管方向），将管底部少量液体用微量加样器吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥5min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
1.1.9.于干燥后的沉淀中加入8ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，离心5sec，冰上保存备用（注意:此时的RNA最易受RNase降解，请在2小时内进行逆转录）。
1.2．使用Roche公司的样本处理试剂（High Pure Viral RNA Kit）操作流程:
1.2.1.提取试剂准备:将40ml无水乙醇加入到Wash buffer中；将20ml无水乙醇加入到Inhibitor removal buffer中制成Inhibitor removal buffer工作液；用400 ul Elution buffer溶解Poly(A) carrier RNA后，分别向2瓶Binding buffer中各加入200ul,配制成Binding buffer工作液（此溶液在15—25℃条件下可保存3个月）。
1.2.2.取n个1.5ml体积的灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照），作好标记。
1.2.3.按照（n＋1）×400ul的量取出Binding buffer工作液加入适当体积反应管中，在其中按（n+1）×2ul的量加入内标，颠倒混匀10-15次，即成含内标工作液。该工作液当天用完，否则应盖严管盖密封后丢弃。
1.2.4.在上述各管中加入400ul Binding buffer，然后分别加入待检样本、对照品各200ul，振荡混匀，室温放置10min后转入套有集液管的提取柱，于8,000g离心15sec。
1.2.5.将装有滤出液的集液管丢弃，换上新管，向提取柱中各加入500 Inhibitor removal buffer工作液，于8,000g离心1min。
1.2.6.将装有滤出液的集液管丢弃，换上新管，向提取柱中加入450
