本发明涉及一种肺癌突变基因检测组合物，尤其涉及一组探针组合物以及基于ngs方法检测肺癌基因的试剂盒。
背景技术：
：在临床肿瘤基因检测中ngs具有显著优势。二代测序可以同时检测到常见、罕见突变、基因融合、基因扩增等基因不同突变，指导靶向用药、揭示耐药机制。同时，基于ngs的液体活检技术可实现动态监测，更早提示肿瘤复发和转移。血液中游离的dna为cfdna(cellfreedna)，凋亡的细胞或已脱落的癌细胞体细胞dna就被称作ctdna。ctdna具有与原发癌细胞dna相同的基因突变或特点。这使ctdna具有极高的特异性，可作为高灵敏的生物标记物。由于组织活检技术有许多限制因素。因此ctdna在肿瘤领域中需求更加迫切，如辅助诊断、评估治疗疗效和揭示耐药机制到向肿瘤的复发监测及早筛。为肿瘤患者的诊断治疗起到了重要作用。目前国内cfda批准试剂盒全部为针对ffpe样本，用以检测组织中小panle基因突变，而同时针对液态活检以及新鲜组合和ffpe组织的试剂盒，以及满足肺癌早筛要求的试剂盒目前市场中处于空缺状态。因此，如何能同时满足多类型样本的检测，即做到一盒多检，并且实现肺癌早期检测，是目前肺癌基因检测试剂盒所面临的挑战。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种探针组合物，用于肺癌病人精准治疗的分子诊断技术，支持组织检测和ctdna液态活检，同时结合超高测序深度，可保证检测的灵敏度和结果准确性。本试剂盒中umi双分子标签，能够有效去除背景噪音，杜绝痕量污染，使ctdna检测中灵敏度达到0.1％，真正填补了国内市场中液态活检的空白。本发明所述的探针组合物，是选自核酸序列如seqidno1～75所示的探针中的至少一种，进一步优选为，选自核酸序列如seqidno1～75所示的探针中的n种，其中n为2、3、4、5……～75的整数。本发明所述的探针组合物所针对的肺癌基因，覆盖多种可能的突变类型，包括点突变(snps)，插入和缺失(indels)，基因扩增(cnv)，基因融合(fusion)。本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，包括上文所述的探针组合物。优选地，上文所述的试剂盒，包括上述的探针序列为seqidno.1～no75所示的探针组合物，还包括接头；所述接头为具有umi双分子标签接头或short-y接头；其中，umi双分子标签接头为基于illumina通用接头的基础上添加6-8个碱基序列设计组成。碱基种类共计4^(6-8)个，所述具有umi双分子标签接头用于血浆游离ctdna的检测中接头连接步骤；所述umi序列具有唯一性，每条dna分子对应唯一的umi标签，保证pcr扩增或者测序之后，生信分析人员可以追溯到dna原始模板，从而降低背景噪音，排除假阳性突变的可能。所述short-y接头为商品cat：64199，用于ffpe及组织样本检测的接头连接步骤。本发明所述试剂盒可适用于ffpe、组织样本的分子检测以及血浆ctdna样本的超低频分子检测，可用于肺癌基因检测。利用上述试剂盒可用于基于ngs方法肺癌基因检测，其检测过程包括：样品采集，提取gdna或ctdna，umi分子标签建库，panel杂交，ngs测序，针对测序后的数据进行分析，判断样本的基因型。其中，panel杂交步骤中包括上述的探针序列为seqidno.1～75所示的探针组合物以及接头。本发明的有益效果：1.本试剂盒针对肺癌患者的检测，同时满足ffpe组织、新鲜组织以及全血样本。2.针对每个肺癌基因突变高度相关的区域设计探针，覆盖度高而均一，保证探针的高特异性。同时可一次性检测35个与肺癌突变基因，覆盖靶向用药基因，降低检测成本。3.本发明采用umi双分子标签使ctdna检测中灵敏度达到0.1％，采用short-y接头使组织检测的灵敏度可达到2％。有效去除背景噪音杜绝痕量污染，结合超高深度测序，以保证结果准确性，实现肺癌突变基因的早筛以及实时监测预后复发问题。4.本发明所述探针组合物的设计，是根据nccn指南、fda/cfda指南，结合多个权威数据库，精选35个肺癌发生用药相关基因，包括肺癌获批靶向药物所有相关基因。探针捕获高度均一，同时检测全外显子和涉及基因融合的内含子区域，包括点突变(snps)，插入和缺失(indels)，基因扩增(cnv)，基因融合(fusion)和拷贝数变异。具有前瞻性，为将来产品升级做准备，又给现有患者精准靶向和科研提高了更多的可能性。5.本发明seqidno1～75所示的探针组合物，覆盖多种可能的突变类型，可以对样品同时进行已知或者未知的突变的检测。对于企业来讲，可用一个panel解决不同患者所提供不同组织类型的问题，既节约成本又节约时间。6.本发明所涉及方法简单，有助于实现产品从实验室向工业应用的转化，具有良好的应用前景。具体实施方式下面结合本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本申请下述实施例中提取ffpe样本基因组gdna使用allprepdna/rnaffpekit(cat:80324)；提取血浆血液游离ctdna使用apostleminimaxtm敏迈高效游离dna分离富集试剂盒(cat：a17622)。qubit定量使用qubitdsdnahsassaykit(cat：q32854)。本试剂盒名称为：nuocancertmlungcancer35genefortissue/nuocancertmlungcancer35geneforcfdna(肺癌35基因检测试剂盒，可以通过商业途径从基恩生物科技(大连)有限公司购买获得)，以下实验均按照该试剂盒说明书进行操作。实施例1本发明建库杂交捕获流程采用的验证方法如下：一、提取基因组gdna或血液游离ctdna，所述基因组gdna或血液游离ctdna均来自医院临床样本，使用qubit定量并质检二、打断，末端修复，加a【注意：针对组织gdna样本执行a操作；针对液态活检ctdna样本执行b操作】1.在pcr仪上设置好以下程序：热盖温度设为70℃，反应液剂量设为50μl。a:gdna反应程序为：4℃下1min，32℃下12min，65℃下30min，4℃保持。b:ctdna反应程序为：4℃下1min，20℃下30min，65℃下30min，4℃保持。运行该程序，当pcr仪温度达到4℃时将程序暂停。2.厚壁pcr管置于冰上，加入gdna200ng或ctdna25ng，加nfw(无核酸酶水)补至35μl。3.加入打断末端修复mix。a:gdna样本中加入5μl的fgb(dna片段化末端修复加a缓冲液)和10μl的wfm(dna片段化末端修复加a酶混合液)；b:ctdna样本中5μl的erb(末端修复尾端加a缓冲液)和10μl的era(末端修复尾端加a酶混合液)。用枪温和地吹打混匀。4.样本管简短离心，立即转移到pcr仪(已设好4℃)中，继续循环程序。5.程序结束后，立即将样本管取出，放在冰上，立即进入接头连接步骤。三、接头连接及纯化1.在冰上pcr管中配lligationmix：lib(dna连接缓冲液)20μl，lig(dna连接酶)10μl，nfw(无核酸酶水)15μl，共计45μl。根据样本数进行配制，计入损耗。2.样本管置于冰上加入5μl接头(当样本类型为组织时，加入从idt购买的cat：64199的shorty接头；当样本类型为血浆ctdna时，加入本发明所述的具有umi双分子标签的接头)和45μl的ligationmix枪上下混匀。3.使用pcr仪温育连接反应液，20℃15min，取消热盖。4.结束温育后立即使用80μlspb(样本纯化磁珠)进行纯化，20μleb回溶。四、加标签，子文库扩增及纯化1.准备扩增引物pcr反应混合物：hpm(增强型pcr混合液)25μl，upm(唯一标签引物混合液)5μl，共计30μl。2.将上步的30μl反应混合物加至20μl的连接后纯化产物中，操作保持在冰上。3.如下表设置pcr仪程序，热盖温度105℃。进行扩增反应。4.pcr循环结束后使用50μlspb(样本纯化磁珠)进行纯化，27μleb回溶。五、子文库质控用qubitdsdnabrassaykit进行定量检测，用agilent2100生物分析仪或agilent4200tapestation进行条带分析。文库浓度大于20ng/μl，主峰在150bp-500bp，则文库合格，可进行下一步杂交反应。六、子文库样本pooling混合、浓缩和杂交1.不同upm的子文库(1-12个)，各取500ng，充分混匀。2.样本浓缩杂交(1)往不同upm子文库混合液中加入7.5μl的hcd(人cot脱氧核糖核酸片段)。(2)再加入2倍体积的spb(样本纯化磁珠)，彻底混匀，室温静置10min。(3)提前配制杂交反应mix：hyb(杂交缓冲液)9.5μl，hye(杂交增强缓冲液)3μl，hub(杂交公用阻断剂)2μl，cpd-35(35基因肿瘤探针)探针4.5μl，共计19μl。(4)将离心管置于磁力架上至少2min直至上清澄清。(5)吸除上清，80％的乙醇清洗2遍。17μl杂交反应mix回溶至pcr管。(6)pcr仪热盖温度设为100℃，杂交程序为：95℃下30sec，65℃下16h，65℃保持。启动pcr程序杂交16-20h。七、捕获洗脱1.提前准备buffer试剂(1)将smb(链霉亲和素磁珠)平衡至室温。10×清洗液室温放置至完全融化。(2)清洗液稀释成1×工作液(单个杂交文库)，如下表格所示：注意：如果10×wb1浑浊，可以在水浴锅中65℃温育溶解，溶液澄清后才可使用。1×工作液可以在室温(15–25℃)放置最多4周。(3)在pcr管中配制beadresuspensionmix：hyb(杂交缓冲液)8.5μl，hye(杂交增强缓冲液)2.7μl，nfw(无核酸酶水)5.8μl，共计17μl。2.清洗链霉素磁珠(1)漩涡15s使磁珠彻底混匀。(2)按照一个反应50μlsmb(链霉亲和素磁珠)分装至1.7ml低吸附的离心管中。(3)每个杂交用100μl1×bwb(1×链霉亲和素磁珠清洗液)清洗磁珠，重复两次。(4)用配好的17μlbeadresuspensionmix重悬磁珠，彻底混匀。3.磁珠捕获(1)杂交16h后，取出样本。开启wash程序：热盖70℃，程序65℃保持。(2)将beadresuspensionmix重悬磁珠转移到样本杂交pcr管中吹打混匀。(3)将pcr管置于pcr仪上，65℃温育45min。(4)每10-12min在涡旋仪上进行混匀。4.捕获后热清洗【注意：此步要确保热清洗溶液温度为严格的65℃】(1)孵育45min后，加入100μl65℃预热的1×wb1(1×清洗液1)，枪混匀10次。(2)将磁珠溶液管置于磁力架上，直至上清澄清，将液体完全去除干净。(3)往样本管中加入150μl65℃预热的1×swb(1×增强型清洗液)。枪吹打混匀。在水浴中孵育65℃，5min。将离心管置于磁力架上放置1min，去上清。(4)重复步骤七.4.(3)一次。5.捕获后室温清洗(1)往磁珠中加入150μl的1×wb1(1×清洗液1)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，充分混匀。(2)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。(3)往磁珠中加入150μl的1×wb2(1×清洗液2)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，确保充分混匀。(4)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。(5)往磁珠中加入150μl的1×wb3(1×清洗液3)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，充分混匀。(6)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。(7)将离心管置于离心机上短暂离心，将残余的1×wb3(1×清洗液3)去除干净。(8)加入20μlnfw(无核酸酶水)到磁珠中，吹打混匀使磁珠完全重悬。八、富集文库扩增1.按照下表设置pcr仪程序，热盖温度设置为105℃。2.配制扩增反应mix：hpm(增强型pcr混合液)25μl，lap(文库扩增引物)1.25μl，enh(扩增增强液)2μl，nfw(无核酸酶水)1.75μl，共计30μl(单个反应用量)。将上步重悬的链霉素磁珠转移至扩增反应mix的pcr管中。九、富集文库扩增后纯化1.将spb从4℃冰箱取出，平衡到室温。配制新鲜的80％乙醇。2.将75μlspb(样本纯化磁珠)加入到pcr产物中进行纯化，乙醇清洗两次。3.21μleb进行回溶。十、杂交后混合文库质控使用qubitdsdnahsassaykit进行文库浓度检测，使用agilent2100bioanalyzer或者agilent4200tapestation，浓度10ng/μl以下使用高敏试剂盒。根据主峰和浓度，换算摩尔浓度，要求摩尔浓度达到上机要求(如：2nm以上，浓度0.5ng/μl)。文库合格后可以上机测序。文库在-25℃至-15℃下最长可存放30天。实施例2阳性标准品检测：1.使用国际通用标准品：horizon(hd827)公司以及coriellinstitute(na12878humanreferencegdna)进行检测。2.qubit定量，阴性标准品na12878和阳性标准品hd827各200ng建库。3.按照本发明实施例1所述方法进行建库，测序，本实施例2使用illumina平台测序。4.分析得到如下结果：(1)组织版检测结果：基因突变类型refalt突变频率nrassnpgt1.58％ddr2snpcg2.46％alksnpag2.56％pik3casnpga3.01％pik3casnpga3.09％pik3casnpag1.64％ros1snptc4.17％ros1snpct2.45％egfrsnptg2.71％metsnpga2.55％brafsnpat4.19％fgfr1snpca3.36％retsnpct3.35％krassnpag2.73％krassnpct4.47％krassnpct2.00％erbb2snpag3.27％测试总结：肺癌组织版检测产品结果显示，阳性标准品中涵盖肺癌panel中12个与肺癌高度相关基因。且均有检出，生物信息数据分析结果显示最低检测灵敏度达到1.58％。(2)血浆ctdna版检测结果：基因突变类型refalt突变频率nrassnpgt0.17％ddr2snpcg0.36％alksnpag0.32％pik3casnpga0.11％pik3casnpga0.30％pik3casnpag0.41％ros1snptc0.42％ros1snpct0.27％egfrsnptg0.11％metsnpga0.13％brafsnpat0.23％fgfr1snpca0.16％retsnpct0.19％krassnpag0.19％krassnpct0.16％krassnpct0.22％erbb2snpag0.67％测试总结：肺癌血液版检测结果显示，阳性标准品中涵盖肺癌panel中12个与肺癌高度相关基因，且均有检出，生物信息数据分析结果显示最低检测灵敏度达到0.12％。实施例3组织检测临床样本——一例肺癌患者ffpe样本进行ngs建库；按照实施例1所述方法，采用本发明的seqidno1～75条探针序列组成的panel进行组织版检测：1.提取ffpe组织基因组dna，gdna使用总量200ng。2.对提取的gdna进行文库构建，使用pe150illumina测序平台进行测序。3.分析得到如下结果：该样本共检测出8个突变位点，其中egfrp.e746_a750del突变为19号外显子缺失突变，突变频率为35.63％，结合该患者临床诊断为非小细胞性肺癌，腺癌可能性。因此给出可供参考的用药指导药物为：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达可替尼、奥希替尼单药治疗。(其中吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼被纳入《版国家医保目录》且适应症为本癌种)。实施例4ctdna液态活检：临床样本——一例原发性肺腺癌患者，于初进行切除手术，使用液态活检进行预后评估，按照实施例1所述方法，采用本发明的seqidno1～no75条探针序列组成的panel进行ctdna版检测：1.采集10ml外周血，提取ctdna进行液体活检，ctdna使用总量30ng。2.对提取的gdna进行文库构建，使用pe150illumina测序平台进行测序。3.分析得到如下结果：根据此样本的基因检测结果结合该患者目前临床诊断结果：右肺下叶腺癌，患者检测到egfr19号外显子缺失突变，但是频率较低(0.40％)，结合患者既往用药情况(曾检测到19号外显子变异，但是靶向治疗效果不佳)。该患者可考虑以下治疗方案进行治疗：(1)纳武利尤单抗单药；(2)阿特珠单抗单药；(3)西妥昔单抗+阿法替尼联合用药；(4)阿帕替尼+吉非替尼联合用药。综上，由该探针序列构成的肺癌检测试剂盒，可用于组织版及液态活检版检测。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。序列表<110>基恩生物科技（大连）有限公司<120>一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒<130><160>75<170>patentinversion3.5<210>1<211>100<212>dna<213>人工序列<400>1gatcagcgacacgcctcattggtcgagtcgttaatgtgccatcgagatgattggtcagta60catcgtgcgggagtgcacccgggcacccggtatggctcacttg103<210>2<211>100<212>dna<213>人工序列<400>2gcgaaaatgagcccgactgtgtcaatggttcggacgatagataataaagggcagtcaagt60tggagaagacagaggtggctagagaaataaacagcacgcgcca103<210>3<211>100<212>dna<213>人工序列<400>3gcccctgccgcctctgtaggactccgtgatcacattaccctgggacgccactcccgccat60gtgaccccctcaacggttgccgcactcccgccggcggtgacct103<210>4<211>100<212>dna<213>人工序列<400>4gacagaaaccacatgacaccattactctggaggattactatctaaaaatagatgtaattg60ttttgtcattgagcatttgaattacttacaataagaacgatta103<210>5<211>100<212>dna<213>人工序列<400>5taaacataaactaccctagctaactcacctacccacttcagtttctttactatgtgaatt60ttttcattttattcatctttatgggtgattttatgattccgtg103<210>6<211>100<212>dna<213>人工序列<400>6acgtaaattgatcatttctcataaatggggtttaaaaattgattatgatagatttcatgt60ttttttgacattcccaacgtccattatagtcaacaagccttag103<210>7<211>100<212>dna<213>人工序列<400>7atgagatataatggggtgcgctgtgaagtgtcggttattcgattatagcgagtgaaggaa60cactcggcggagattgtctgaattgcagatacctgatcgaatt103<210>8<211>100<212>dna<213>人工序列<400>8gttattaggaagaatccgggataattgcattcaacgacccaattcaaatgagtaattttc60cataacagaaccataatactacatggcgtgttcaactcagcag103<210>9<211>100<212>dna<213>人工序列<400>9cagcagtggttctatgtgcttggacagggtcgcattcggtcggtcgctgcccgtcgcccg60accccctgacaccgtggcagaggctcatcgagcggccgcctga103<210>10<211>100<212>dna<213>人工序列<400>10cgtcgtcggcaagtctcgtctggtaggcgattaatgggttcgccgcggccgtggaaggat60atgaggcgtgtcagtcagccgggagcgggcctggatcgggtat103<210>11<211>100<212>dna<213>人工序列<400>11ctagcggcgagggctgtcggttgtggatatgaacatacgggggagtggacgttccctgat60atagaccaggcctcggctaaagtccgccgtccttatcggctgg103<210>12<211>100<212>dna<213>人工序列<400>12agtccagtaacatatcagaaaactttatggtataggcggagcgatttggtaaaatccagg60cacggagttcgtatatgactactctttagcagcttatgaagtc103<210>13<211>100<212>dna<213>人工序列<400>13catggctatcgatttcttgttgcctacgctcgcataaaggcgctactttttttaacctta60tggcaaaacccctggcctggatatgggcggtggttcctattta103<210>14<211>100<212>dna<213>人工序列<400>14gagtcgttatagctattccaccggtattattaatacttatcaaaaattacctaactattt60tctgtgtaactatacatatgatacgtaagatccaatattaggc103<210>15<211>100<212>dna<213>人工序列<400>15attcttttcttgccaatatagcgataaggtgtaataaccattcaatccaacaatccaact60tcctcatctctttatagcgtgttacaccaactgtacgtctcaa103<210>16<211>100<212>dna<213>人工序列<400>16atagtcaggcatctaattatatcaccttgaatgggaattgtaaggacccagtttccggtt60gatagcctaaccacttgacggctctgataacccttctctctta103<210>17<211>100<212>dna<213>人工序列<400>17aattaatactagttgtaatccctttcaagttgatacatcggggcgagatttatcgaattg60gagttgtaaccacaatcttatccaaccataaccgaaaagatca103<210>18<211>100<212>dna<213>人工序列<400>18atcttttcctatggttcactgtgtacgcatgaagggaaatcggatccgactttgtgtcac60aaataccggctaacagacacgacttattgcaagggcccatttt103<210>19<211>100<212>dna<213>人工序列<400>19gcatgcgcgaagtgcctagctcgttacatgtgctacctgatcagtgcccagatgtcaacg60ttgataccttaaa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技术特征：
1.一种探针组合物，其特征在于：选自核酸序列如seqidno.1～75所示的探针中的至少一种。
2.一种用于肺癌基因检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的探针组合物。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括接头，所述接头为具有umi双分子标签的接头或short-y接头；其中，所述具有umi双分子标签的接头为在基于illumina通用接头的基础上添加6-8个碱基序列随机组成。
4.权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒适用于ffpe、组织及外周血ctdna的分子检测。
5.权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于基于ngs方法肺癌基因检测。
技术总结
本发明公开了一种基于NGS方法检测肺癌基因突变的探针组合物及试剂盒。所述探针组合物选自核酸序列如SEQ ID NO 1～75所示的探针中的至少一种，其试剂盒适用于FFPE、组织及外周血ctDNA的基于NGS方法的肺癌基因突变检测，进而实现肺癌突变基因早筛和实时监测复发等目的。本发明独特设计的UMI双分子标签可以有效降低背景噪音，杜绝痕迹污染，去除假阳性，保证结果的准确性，使ctDNA检测中灵敏度达到0.1％。在组织检测中使用通用Short‑Y接头，其检测灵敏度可达到2％。给患者精准靶向治疗提供了更多的可能性。组织样本与血浆样本建库工作流程相似，保证流程的简便性，省时高效，易操作。
技术研发人员：丁岩
受保护的技术使用者：基恩生物科技(大连)有限公司
技术研发日：.11.25
技术公布日：.02.14
