本发明涉及一种met基因外显子14突变检测方法，特别涉及一种met基因外显子14跳跃突变检测的引物组、检测方法和试剂盒，属于基因检测
技术领域：
。
背景技术：
：met也称为c-met，为原癌基因，是受体酪氨酸激酶家族的成员之一,具有酪氨酸激酶活性。met受体与肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,hgf)结合，可诱导met二聚体处于激活状态，从而产生磷酸化，激活了下游信号通路。这种的传递异常会造成多方面的影响：包括细胞生长、侵袭及转移等。持续的信号传递会造成细胞过度增殖，因此导致肿瘤的发生与进展。met14外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的总发生率为3％-6％，在肺腺癌中的发生率为3％-4％，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22％。另外其他癌症类型如胃癌，结直肠癌，脑胶质瘤都发现了met基因的14号外显子跳跃突变。研究表明met外显子14突变nsclc患者即使具有高突变负荷(tmb)和pd-l1强阳性，接受免疫治疗仍然疗效不佳。然而met外显子14突变患者接受靶向治疗疗效不错。有报道克唑替尼治疗met外显子14突变的晚期肺癌有显着和持久的反应(肿瘤部分缓解)，其后陆续有多个met靶向药治疗met外显子14跳跃突变的晚期肺癌疗效良好的案例报道。所以较有希望作为肺癌靶向治疗靶点的就是met外显子14跳跃突变。目前对于met外显子14跳跃突变的检测方法是二代基因测序即全外显子测序，简单来说就是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域dna捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法覆盖面广，可以同时检测一系列的癌症相关基因。但是它的过程繁琐，需要较长的建库和检测周期，而且后期的下机数据庞大，需要专业的生物信息人员进行筛选与分析，无法形成标准化的分析流程。同时检测的价格也是相当昂贵，会对患者造成很大的经济负担。基于此，有必要提供一种新的met外显子14跳跃突变检测方案来克服上述缺陷。技术实现要素：为了解决上述met基因外显子14跳跃突变检测方法中存在的操作繁琐、结果解读困难、标准难以统一化等问题，本发明提供一种操作简单、准确性高、敏感性高且便于开展的检测方法，基于多重snapshot扩增技术设计met外显子14检测的引物组、试剂盒及其方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，该引物组包括两部分：一、3对特异性引物：snp1-f：5"-atgcagaaagcctggagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.1所示；snp1-r：5"-acatggtggctgtccttcat-3"，核苷酸序列如seqidno.2所示；snp2-f：5"-atcgagaatactgcctggag-3"，核苷酸序列如seqidno.3所示；snp2-r：5"-ggccaaaatctccaaagtca-3"，核苷酸序列如seqidno.4所示；snp3-f：5"-gcagaaagcctggagagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.5所示；snp3-r：5"-acatggtggctgtccttcatt-3"，核苷酸序列如seqidno.6所示；二、3条延伸引物：snp1的延伸引物：tgcaaaagacacgcaaaatc，核苷酸序列如seqidno.7所示；snp2的延伸引物：cccccccc-tggccaaaatctccaaagtc，核苷酸序列如seqidno.8所示；snp3的延伸引物：cccccccc-atgtgcaaaagacacgcaaa，核苷酸序列如seqidno.9所示。一种met基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组。一种所述的试剂盒在用于非治疗与诊断目的met基因外显子14突变测序中的应用。一种met基因外显子14跳跃突变的检测方法，该方法包括如下步骤：①提取检测样本总rna，对所述rna实施逆转录反应以产生cdna；②使用权利要求1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，对所提取的样品进行snapshot多重扩增和单碱基延伸；③根据snapshot多重扩增结果，分析met外显子14跳跃突变的情况。作为优选，步骤②中所述多重扩增反应程序为：95℃3分钟，95℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；95℃5分钟，94℃45s，67℃退火60℃每循环降0.5℃，72℃2分钟，11个循环；94℃45s，57℃退火50℃每循环降0.5℃，72℃2分钟，11个循环；72℃10分钟。作为优选，步骤②中所述单碱基延伸反应程序为：96℃1min，95℃变性10s，55℃退火5s，60℃延伸30s，共28个循环。由于met第14外显子跳跃突变一般不与egfr、kras、alk等肺癌其他敏感突变共存。导致metexon14在转录水平跳跃缺失的原因主要是metexon14剪接区域的点突变或缺失突变，而且美国癌症基因研究组(thecancergenomeatlas，tcga)通过对mrna和dna高通量测序结果及序列比对分析，发现患者存在met14外显子剪接位点突变，导致met第14外显子在mrna水平出现部分或完全跳跃缺失。基于此，发明人针对metexon14在转录水平存在的跳跃缺失现象，基于其突变位点设计了3对特异性引物。发明人依据omim和clinvar遗传数据库，并收集了中国人群所特有的突变区域，采用不同的软件进行设计如primrpremier5、oligo、omiga等，并结合相应的探针设计系统，通过不断优化引物序列，得到检测跳跃突变的准确结果。本发明的有益效果是：1、本发明提供一种met外显子14跳跃突变检测的引物、体系以及相应的试剂盒。与常规的方法相比，本方法具有操作简单、快速、通量大、灵敏性高的特点；2、本发明的检测方法更为安全和高效，而且对样品的容受性高，便于临床应用。同时检测结果更直观、易读，具有可重复性。附图说明图1是实施例中一代测序结果图；图2是实施例中多重snapshot扩增结果图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1一种met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，该引物组由以下两部分组成：一、3对特异性引物：snp1-f：5"-atgcagaaagcctggagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.1所示；snp1-r：5"-acatggtggctgtccttcat-3"，核苷酸序列如seqidno.2所示；snp2-f：5"-atcgagaatactgcctggag-3"，核苷酸序列如seqidno.3所示；snp2-r：5"-ggccaaaatctccaaagtca-3"，核苷酸序列如seqidno.4所示；snp3-f：5"-gcagaaagcctggagagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.5所示；snp3-r：5"-acatggtggctgtccttcatt-3"，核苷酸序列如seqidno.6所示；二、3条延伸引物：snp1的延伸引物：tgcaaaagacacgcaaaatc，核苷酸序列如seqidno.7所示；snp2的延伸引物：cccccccc-tggccaaaatctccaaagtc，核苷酸序列如seqidno.8所示；snp3的延伸引物：cccccccc-atgtgcaaaagacacgcaaa，核苷酸序列如seqidno.9所示。实施例2一种met基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒，该试剂盒含有实施例1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组。实施例3一种met基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒，该试剂盒含有实施例1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，该试剂盒内组分为：10*pcrbuffermix1μl特异性引物mix0.4μldntp0.3μldna聚合酶0.1μl模板cdna1μlrnasefreedh2o7.2μl总体积10μl实施例4一种met基因外显子14跳跃突变的检测方法，具体步骤是：一、提取检测样本总rna，对所述rna实施逆转录反应以产生cdna；使用血液rna提取试剂盒qiaamprnabloodminikit(catalogno.52304)提取患者和正常人群的血液rna。按照试剂盒的说明操作如下：1、加入五倍体积的bufferel，冰上孵育15分钟，期间用枪吹吸混匀两次。4℃，400xg离心10min，弃上清。2、加入bufferel并轻轻涡旋混匀。4℃，400xg离心10min，弃上清。3、加入bufferrlt轻轻混匀，把全部液体转移到qiashredderspincolumn中，最大转速离心2分钟，弃掉吸附柱。4、在滤液中加入等体积70％乙醇，轻轻混匀，把所有的液体转移到qiaampspincolumn中，以大于8000xg速度离心15秒，弃掉滤液。5、在qiaampspincolumn中加入700μlbufferrw1，以大于8000xg速度离心15秒，弃掉滤液。6、在qiaampspincolumn中加入500μlbufferrpe，20,000xg离心3分钟，弃掉滤液，再全速离心1分钟。7、吸取50μlrnase-freewater直接加入到qiaamp吸附柱中，室温8000xg离心1min，把收集到的核酸重新过柱，收集提取的核酸。使用nanodropone超微量分光光度计对所提取的样品进行检测，260/280范围是1.9-2.0，核酸的浓度为15-35ng/vl。使用takara的primescriptrtreagentkit(catalogno.rr037a)，配制反转录体系如下：反转录反应条件如下：37℃15min；85℃5s，把处理好的样品保存在-20℃备用。二、使用met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，对所提取的样品进行snapshot多重扩增和单碱基延伸。1、使用经过上述步骤得到的cdna样品进行pcr扩增反应。反应体系如下，总体系为10μl：10*pcrbuffermix1μl特异性引物mix0.4μldntp0.3μldna聚合酶0.1μl模板cdna1μlrnasefreedh2o7.2μl总体积10μl反应程序如下：pcr反应程序在bioradt100普通pcr仪上进行。反应体系中所述特异性引物是met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，该引物组包括两部分：①3对特异性引物：snp1-f：5"-atgcagaaagcctggagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.1所示；snp1-r：5"-acatggtggctgtccttcat-3"，核苷酸序列如seqidno.2所示；snp2-f：5"-atcgagaatactgcctggag-3"，核苷酸序列如seqidno.3所示；snp2-r：5"-ggccaaaatctccaaagtca-3"，核苷酸序列如seqidno.4所示；snp3-f：5"-gcagaaagcctggagagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.5所示；snp3-r：5"-acatggtggctgtccttcatt-3"，核苷酸序列如seqidno.6所示；②3条延伸引物：snp1的延伸引物：tgcaaaagacacgcaaaatc，核苷酸序列如seqidno.7所示；snp2的延伸引物：cccccccc-tggccaaaatctccaaagtc，核苷酸序列如seqidno.8所示；snp3的延伸引物：cccccccc-atgtgcaaaagacacgcaaa，核苷酸序列如seqidno.9所示。2、pcr扩增反应产物进行单碱基延伸反应反应程序如下：单碱基延伸反应在bioradt100普通pcr仪上进行。3、反应结束后在体系中加入hi-di和内标(购自abi公司)，10，000rpm离心5min。把反应体系置于冰上10min，然后于abi公司3500遗传分析仪进行毛细管电泳，应用genemaperv4.0软件进行数据分析。三、根据snapshot多重扩增结果，分析met外显子14跳跃突变的情况。通过3500遗传分析仪进行毛细管电泳的结果，分析met外显子14跳跃突变的情况。同时用上述样品做一代测序。使用seqman软件分析一代测序结果。把一代测序结果与分析仪的峰图进行比对。通过图1和图2所示的结果比较可知，分析软件可以直观地呈现出患者位点的突变情况。3500遗传分析仪的峰图与一代测序的结果的突变情况是一致的，说明本试剂盒结果的准确性。实施例5试剂盒在用于非治疗与诊断目的met基因外显子14突变测序中的应用1、使用11例经外显子测序证实是met外显子14跳跃突变的患者样品，其中男性患者6例，女性患者5例。2、按照如下的反应体系加入相应的反应成分：10*pcrbuffermix1μl特异性上游引物(10μm)0.2μl特异性下游引物(10μm)0.2μldntp(10mmol/l)0.3μldna聚合酶(5u/vl)0.1μl模板1μlrnasefreedh2o7.2μl总体系10μl本发明试剂盒与商品化试剂盒a(世和基因met14跳跃突变检测试剂盒)、商品化试剂盒b(基佳met14跳跃突变检测试剂盒)进行比较，进一步表明本试剂盒优于商品化试剂盒a和b，同时准确性与外显子测序一致。临床标本检验结果见表1。表1检测样本数突变检出数突变检出率本发明试剂盒1111100％试剂盒a11873％试剂盒b11545％外显子检测结果见表2。表2患者外显子检测本发明试剂盒对比结果1号男性突变突变一致2号男性突变突变一致3号男性突变突变一致4号男性突变突变一致5号男性突变突变一致6号男性突变突变一致1号女性突变突变一致2号女性突变突变一致3号女性突变突变一致4号女性突变突变一致5号女性突变突变一致以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。序列表<110>苏州璞瑞卓越生物科技有限公司<120>met基因外显子14跳跃突变检测的引物组、检测方法和试剂盒<130>w-hly19-108<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(snp1-f)<400>1atgcagaaagcctggagaga20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(snp1-r)<400>2acatggtggctgtccttcat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(snp2-f)<400>3atcgagaatactgcctggag20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(snp2-r)<400>4ggccaaaatctccaaagtca20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(snp3-f)<400>5gcagaaagcctggagagaga20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(snp3-r)<400>6acatggtggctgtccttcatt21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(snp1)<400>7tgcaaaagacacgcaaaatc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(snp2)<400>8tggccaaaatctccaaagtc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(snp3)<400>9atgtgcaaaagacacgcaaa20当前第1页1 2 3
技术特征：
1.一种met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，其特征在于该引物组包括两部分：
一、3对特异性引物：
snp1-f：5"-atgcagaaagcctggagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.1所示；
snp1-r：5"-acatggtggctgtccttcat-3"，核苷酸序列如seqidno.2所示；
snp2-f：5"-atcgagaatactgcctggag-3"，核苷酸序列如seqidno.3所示；
snp2-r：5"-ggccaaaatctccaaagtca-3"，核苷酸序列如seqidno.4所示；
snp3-f：5"-gcagaaagcctggagagaga-3"，核苷酸序列如seqidno.5所示；
snp3-r：5"-acatggtggctgtccttcatt-3"，核苷酸序列如seqidno.6所示；
二、3条延伸引物：
snp1的延伸引物：tgcaaaagacacgcaaaatc，核苷酸序列如seqidno.7所示；
snp2的延伸引物：cccccccc-tggccaaaatctccaaagtc，核苷酸序列如seqidno.8所示；
snp3的延伸引物：cccccccc-atgtgcaaaagacacgcaaa，核苷酸序列如seqidno.9所示。
2.一种met基因外显子14跳跃突变检测的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组。
3.一种权利要求2所述的试剂盒在用于非治疗与诊断目的met基因外显子14突变测序中的应用。
4.一种met基因外显子14跳跃突变的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①提取检测样本总rna，对所述rna实施逆转录反应以产生cdna；
②使用权利要求1所述的met基因外显子14跳跃突变检测的引物组，对所提取的样品进行snapshot多重扩增和单碱基延伸；
③根据snapshot多重扩增结果，分析met外显子14跳跃突变的情况。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤②中所述多重扩增反应程序为：
95℃3分钟，
95℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；
95℃5分钟，
94℃45s，67℃退火60℃每循环降0.5℃，72℃2分钟，11个循环；
94℃45s，57℃退火50℃每循环降0.5℃，72℃2分钟，11个循环；
72℃10分钟。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤②中所述单碱基延伸反应程序为：
96℃1 min，
95℃变性10s，55℃退火5s，60℃延伸30s，共28个循环。
技术总结
本发明涉及一种MET基因外显子14突变检测方法，特别涉及一种MET基因外显子14跳跃突变检测的引物组、检测方法和试剂盒，属于基因检测技术领域。一种MET基因外显子14跳跃突变检测的引物组，该引物组包括两部分：一、核苷酸序列如SEQ ID No.1‑6所示的3对特异性引物；二、核苷酸序列如SEQ ID No.7‑9所示的3条延伸引物。与常规的方法相比，本方法具有操作简单、快速、通量大、灵敏性高的特点；本发明的检测方法更为安全和高效，而且对样品的容受性高，便于临床应用。同时检测结果更直观、易读，具有可重复性。
技术研发人员：张惠丹;戴敬;刘琦;赵洪玉
受保护的技术使用者：苏州璞瑞卓越生物科技有限公司
技术研发日：.12.06
技术公布日：.02.14
