胃癌(GC)是一个相当大的全球卫生负担;高级 GC 患者的中位生存期小于1年肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)是肿瘤治疗失败的主要原因，其中包括 GC 2，但是目前对 CSCs 干细胞维持干细胞功能的机制仍然知之甚少。
KDM4C，也称为 JMJD2C/GASC1，是 Jumonji domain-2家族组蛋白去甲基化酶的成员，该蛋白最初被认为是一种癌基因，在 KYSE-150食管癌细胞系中被扩增在几种类型的癌症中，KDM4C 的失调与肿瘤发生密切相关;基因表达的表观遗传调控是主要机制KDM4C 在胚胎干细胞和肿瘤干细胞中也发挥着重要作用。3,4 KDM4C 抑制剂，如 SD70，已被开发用于抗癌治疗。我们的结果从免疫组织化学的临床样本研究证实了这一点(图。1a 及附图。S1a).然而，在低分化的 GC 组织中，KDM4C 的表达明显上调(图。1a) ，并与 GCSCs 标记正相关(图2。1b 及补充图。第1b 条)。此外，高表达的 KDM4C 预示低分化 GC 患者预后不良(图)。表明 KDM4C 在肿瘤干细胞中具有潜在的作用。另一方面，aldehyde 活性升高是原始神经干细胞的重要特征之一;ALDH 家族成员已被认为是各种实体肿瘤的 CSCs 标志物，并通过代谢信号(如 ALDH- 依赖的维甲酸(RA)信号)发挥重要作用因此，阐明 ALDH 家族成员的上游调控机制对于制定针对肿瘤干细胞的治疗策略具有重要意义。通过蛋白质组学研究、途径分析和 Q-PCR (quantitative real-time PCR)验证，我们发现 ALDH1A3在高表达 kdm4c 的 GC 细胞中被上调。S2及 Fig。3) ，表明 KDM4C 和 ALDH1A3之间的潜在联系。鉴于 KDM4C 和 ALDH1A3的重要作用和我们以前的观察，我们在本研究中探讨了 KDM4C 和 ALDH1A3对原代培养的神经干细胞的作用及其作为治疗靶点的可能性。
图。1
为了证实 KDM4C 的作用，我们用 Q-PCR 方法检测了 KDM4C 在 GCSCs 中的表达水平。与贴壁培养、 CD44-和 ALDH-细胞相比，悬浮培养的球状细胞、 CD44 + 细胞和 ALDH + 细胞中的 KDM4C 明显增高(图2)。S4a).KDM4C 过量表达(补充图。S4b)提高了细胞系和原代 GC 细胞的干性，表现为串联成球能力的增强。1d)、 CD44、 CD133、 SOX2、 OCT4等肿瘤标志物的表达(补充图。S4c)、 ALDH 活性(图。S4c)、成球细胞和肿瘤起始细胞的频率(图。1e) ，以及多代致瘤性(补充图。S4d).KDM4C 基因敲除或 KDM4C 抑制剂处理均能显著抑制 GC 细胞的干性，包括系列成球能力、标记物表达、 ALDH 活性和成球细胞频率(补充图。S5a-g).这些结果表明，KDM4C 促进了 GC 细胞的干细胞化。
接下来我们研究了 ALDH1A3在肿瘤干细胞中的作用。获得了类似的结果;ALDH1A3在中低分化的 GC 组织中异常上调(补充图。S6a) ，与 GCSCs 标记正相关(补充图。S6b) ，并预测预后不良(补充图。S6c).ALDH1A3的异位表达增加了系列成球能力、 GCSCs 标志物的表达、 ALDH 活性、成球和启动肿瘤细胞的频率以及多代肿瘤生成能力。S6d-h)在气相色谱(GC)细胞中的表达。ALDH1A3基因敲除和 ALDH1A3抑制剂 CM10处理，抑制系列成球能力、 GCSCs 标志物表达和 ALDH 活性(补充图。S7a-e).这些结果表明 ALDH1A3对 GC 干性有正向调节作用。
由于 KDM4C 是一个组蛋白去甲基化酶，3,4我们检测了 KDM4C 诱导的组蛋白去甲基化是否参与了 GC 干性和 ALDH1A3转录的调节。在低分化的 GC 组织中，发现 KDM4C 与 ALDH1A3之间存在正相关关系。S8a).通过 Q-PCR、荧光素酶报告试验、核苷酸运转试验和荧光素酶报告试验，证明 KDM4C 对 ALDH1A3的转录具有正向调控作用。结果表明，KDM4C 对 ALDH1A3蛋白的稳定性没有明显的影响。S8d).结果表明，在 ALDH1A3基因启动子上，KDM4C 直接与 ALDH1A3基因启动子结合，对 H3K9me2和 H3K9me3基因表达产生负调控作用。1f).只有野生型抗 shRNA 突变体 KMD4C (H190A 和 E912A)和去甲基化酶死亡突变体 KMD4C (H190A 和 E912A)能够恢复 aldh1a3mrna 水平(图2。1g)及茎状物质(补充图。结果表明，kdm4c 击倒细胞中 S8e-g 蛋白的表达明显高于 kdm4c 击倒细胞。此外，缺乏 ALDH1A3或 ALDH1A3抑制剂处理显著消除了 KDM4C 对 GC 细胞系列成球能力、 GCSCs 标志物表达和 ALDH 活性的影响(图2)。1h，i 及补充图。S9).这些结果表明，KDM4C 通过组蛋白去甲基化激活 ALDH1A3转录，这一过程对于 KDM4C 诱导的 GC 干性维持至关重要。
我们接下来发现，激活的 ALDH1A3反过来激活 KDM4C。同样，ALDH1A3上调了 KDM4C 的转录水平(图。1j 及补充图。S10a) ，ALDH1A3对 KDM4C 的稳定性没有影响(补充图。第10b 条)。ALDH1A3与 KDM4C 启动子之间不存在直接结合。第10c 条)。ALDH1A3产物全反式维甲酸(ATRA) ，一种具有转录调控特性的核受体，治疗后也获得了相似的增加转录的 KDM4C (补充图。S10d) ，消融 PU 可消除这一效应(一个 ATRA 受体)(图。1k 及辅助图。S10e，f).此外，KDM4C 缺失或 KDM4C 抑制剂处理显著地消除了 ALDH1A3对 GC 干性的影响(补充图。S11).这些结果表明 ALDH1A3通过 RA 信号转导激活 KDM4C 以支持 GC 干性，并揭示了一个重要的前馈机制，即 KDM4C-ALDH1A3环，用于维持 GC 干性。
接下来我们研究了 KDM4C-ALDH1A3环是否可以作为根除 GCSCs 的药物靶点。结果发现，KDM4C 和 ALDH1A3的消融均能减少球源性 GC 细胞形成的肿瘤体积和肿瘤细胞中 GCSCs 标志物的表达，同时消融可导致小鼠的协同效应。1l 及附图。S12a，b).使用抑制剂进行处理也得到了类似的结果(补充图。S12c).由于肿瘤干细胞对化疗药物具有耐药性，我们进一步研究了 KDM4C 和 ALDH1A3抑制剂的增敏作用。在体外培养条件下，证实了球源性 GC 细胞的耐药性(补充图。KDM4C 和 ALDH1A3的过表达产生了类似的抗性(补充图。第13b 条)。正如预期的那样，KDM4C 和 ALDH1A3的击倒和抑制剂的处理在体外对5-FU 和顺铂敏感(补充图。S13c)和体内(图。1m 和附加图 s13d) ，同时抑制产生协同效应(补充图。13c，1 m，和 S13d)。此外，KDM4C 和 ALDH1A3基因的敲除延长了荷瘤小鼠的存活时间。第13e 条)。
总之，本研究揭示了一个重要的前馈机制，即 KDM4C-ALDH1A3环，用于维持胃癌细胞的干性，这将成为根除人类胃癌细胞的一个新的治疗靶点。
