作者：微生态
编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。
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导读甲病毒是节肢动物传播的RNA病毒，可在全球范围内引起人类感染和疾病的流行。这些病毒根据其遗传相关性和引起的临床综合征被分为致关节炎性或脑炎性病毒。虽然目前还没有批准的甲病毒治疗方法或疫苗，但单克隆抗体的被动转移在动物模型中具有保护作用。本综述强调了甲病毒入侵所需的宿主因素、保护性抗体抑制甲病毒感染周期中不同步骤的作用机制以及目前正在进行临床评估的以体液免疫为重点的候选甲病毒疫苗的最新进展。全面了解甲病毒入侵和抗体介导的保护作用可能有助于开发针对这些新出现病毒的新对策。
论文ID
原名：A molecular understanding of alphavirus entry and antibody protection
译名：对甲病毒入侵和抗体保护的分子理解
期刊：Nature Reviews Microbiology
IF：78.297
发表时间：.12
通讯作者：Michael S. Diamond
通讯作者单位：美国华盛顿大学医学院
DOI号：10.1038/s41579-022-00825-7
综述目录
1 前言
2甲病毒感染周期和结构
3甲病毒入侵
4保护性单克隆抗体
5抗体疗法的开发
6甲病毒疫苗
7结语
主要内容
1前言
甲病毒是Togaviridae科的单链正义RNA病毒，可引起全球范围内的暴发，发病率很高。基于其遗传亲缘性和临床表现，这些病毒被分为几组。致关节炎性甲病毒，包括基孔肯雅病毒(CHIKV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BFV)等，可引起以发热、皮疹、关节痛、肌痛、肌炎以及急性和慢性多关节炎为特征的肌肉骨骼疾病。脑炎性甲病毒，包括东部马脑炎病毒(EEEV)、西部马脑炎病毒(WEEV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，感染中枢神经系统细胞并引起脑膜炎和脑炎，通常伴有长期的神经衰弱后遗症。 城市化和气候变化等社会经济和生态因素影响了蚊媒甲病毒的地理分布，并使其出现和传播。甲病毒主要由伊蚊、脉毛蚊和库蚊传播，有利于许多哺乳动物和鸟类宿主的感染。例如，在过去的二十年中，CHIKV在非洲和东南亚引起大规模流行。至，La Réunion岛爆发了疫情，报告了266000例CHIKV感染病例。随后非洲和亚洲也出现了大规模流行，至CHIKV在加勒比岛屿和美洲出现并传播，出现了数百万例感染者。在澳大利亚RRV和BFV是地方性和地方性动物病，MAYV正在中美洲和南美洲兴起。脑炎性甲病毒令人担忧，因为它们能够引起严重的神经系统疾病，并且有可能用于生物战。1995年南美洲爆发的VEEV疫情导致超过75000人感染，其中300人死亡。美国每年都会发生EEEV疫情，尽管人类感染人数仍然很低，但病死率接近50%。虽然甲病毒具有流行病传播和引起严重疾病的潜力，但现在没有具体的措施来对抗或预防甲病毒感染。
本综述重点强调了我们对甲病毒入侵和抗体介导的保护作用理解的最新进展。
由于已有关于这一主题的其他综述发表，在此我们主要关注新的进展。功能基因组筛选和人单克隆抗体分离方法等技术进步促进了新的机制见解和策略的发展，以对抗新出现和再发甲病毒感染。
2甲病毒感染周期和结构
甲病毒RNA基因组(~12 kb)编码4种非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)和5种结构蛋白(capsid、E3、E2、6K/TF和E1)。这些蛋白共同介导病毒转录、复制和宿主细胞拮抗作用。70 nm病毒粒子的表面由80个按T=4二十面体对称排列的三聚体E2-E1异二聚体棘突组成(图1)。每个三聚体亚基都可以介导病毒附着和入侵，E2和E1是中和抗体的主要靶点。
E3和E2糖蛋白被合成为前体p62蛋白，随后被furin裂解。E3糖蛋白是其他结构蛋白折叠的伴侣蛋白，可防止E2-E1异二聚体在通过分泌途径的酸性环境时过早发生构象变化。虽然E3糖蛋白在成熟过程中被裂解，但对于某些甲病毒(例如SINV和CHIKV)，它可以继续与成熟的E2-E1异二聚体结合。E3解离还取决于培养基pH值和感染细胞的融合。E2蛋白包括三个结构域(A、B和C)，结构域A位于三聚体棘突的中心，结构域B位于棘突的最外端，结构域C位于病毒膜的近端。E2蛋白在附着于细胞受体中起关键作用，是中和抗体的主要靶标。虽然6K/TF膜蛋白与糖蛋白加工以及病毒粒子装配和释放有关，但其确切作用尚不清楚。此外，由于其疏水性，在用于结构分析的重组蛋白制剂中这些跨膜蛋白已被排除在外。E1蛋白是II类融合蛋白，由三个结构域(I、II和III)组成，并通过疏水肽介导病毒膜融合。虽然融合肽通常隐藏在E2结构域B下方，但在早期核内体期暴露于低pH值时，E1蛋白会发生重排，从而使融合肽插入宿主脂质膜。核内体膜融合后，核衣壳进入细胞质并分解，基因组病毒RNA被释放并翻译。非结构蛋白形成复制复合体，用于随后的基因组和亚基因组病毒RNA合成。亚基因组RNA编码病毒结构蛋白，这些结构蛋白被转运到内质网，并转运到高尔基复合体中进行糖蛋白的加工和成熟。新合成的基因组RNA被衣壳蛋白包裹，形成核衣壳核心。经过加工的糖蛋白和核衣壳通过分泌途径或细胞病变液泡II型途径转运到质膜，进行病毒粒子装配和出芽。
图1. 甲病毒结构和入侵机制。
甲病毒病毒粒子(PDB ID：6NK6)由80个按T=4二十面体对称排列的三聚体E2-E1异二聚体棘突(蓝色)组成。E2–E1异三聚体显示在左图中，E2蛋白以浅青色、中青色和深青色表示，E1蛋白以浅灰色、中灰色和深灰色表示。E2和E1结构蛋白通过几种附着因子(即硫酸乙酰肝素、C型凝集素受体(DC-SIGN和L-SIGN)和磷脂酰丝氨酸受体(TIM1、TIM4和AXL164))和受体(NRAMP2、MXRA8、LDLRAD3、VLDLR70和ApoER2)介导甲病毒的入侵。附着后，甲病毒病毒粒子经网格蛋白介导的内化(内吞作用)，随后核内体膜融合。核衣壳在细胞质中分解，释放病毒RNA，编码四种非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)和五种结构蛋白(capsid、E2、6K/TF和E1)。在翻译输入病毒RNA后合成病毒非结构蛋白，以产生用于合成额外基因组(蓝色)和亚基因组(绿色)病毒RNA的复制复合体。亚基因组病毒RNA编码病毒结构蛋白，这些结构蛋白在内质网(ER)和高尔基复合体中加工，随后被转运到质膜进行病毒粒子的装配和出芽。
3甲病毒入侵甲病毒入侵细胞需要附着因子、受体和内吞作用的参与。
甲病毒广泛的细胞嗜性部分是由于附着和入侵过程中利用了多种宿主因子。最近进行的功能基因组学和生化筛选提供了关于关节性和脑炎性甲病毒如何进入细胞的新信息。 甲病毒可以利用多种分子附着在宿主细胞表面(图1)。硫酸乙酰肝素是一种带负电荷的糖胺聚糖，与E2–E1异二聚体中带正电荷的氨基酸相互作用，如CHIKV(E2–R82)、RRV(E2–R218)、SINV(E2–K70和E2–R114)、EEEV(E2–K71、E2–K74和E2–K74)和VEEV(E2–K76、E2–K120和E2–K209)。甲病毒对硫酸乙酰肝素结合的依赖发生在自然状态或在适应细胞培养传代时。获得使硫酸乙酰肝素结合的带正电荷的氨基酸会增加体外病毒感染，但通常会降低体内发病，EEEV除外，其与硫酸乙酰肝素结合可以增加小鼠的神经毒性。C型凝集素是其他报道的甲病毒的附着因子，包括DC-SIGN和L-SIGN。蚊子细胞中产生的SINV使糖基化偏向高甘露糖N-连接低聚糖，显示出与表达DC-SIGN和L-SIGN的细胞的更强结合，这与它们优先结合高甘露糖聚糖的蛋白质一致。磷脂酰丝氨酸受体蛋白，如TIM1、TIM4和AXL，通过与病毒膜上的磷脂酰丝氨酸相互作用促进甲病毒的附着。然而，这些磷脂酰丝氨酸受体增强甲病毒附着和感染的程度取决于病毒和细胞类型，因为在巨噬细胞、角化细胞和肝细胞中观察到利用率的差异。需要进一步的研究来阐明磷脂酰丝氨酸受体蛋白作为甲病毒附着因子的作用及其在发病机制中的作用。
甲病毒真正入侵受体的发现历来具有挑战性。尽管已经使用生化方法和全基因组cDNA筛选鉴定了几种假定的甲病毒受体，但尚未证明与病毒粒子的直接物理结合或宿主因子的基因消融对感染的影响(图1)。利用一组对宿主蛋白有反应的抗体，层黏连素受体被鉴定为SINV的入侵因子。随后的生化研究也表明层黏连素受体是VEEV的受体，并且类似的方法已被用于鉴定其他可能的甲病毒宿主受体。在果蝇细胞中应用全基因组RNA干扰筛选，鉴定出金属离子转运蛋白NRAMP，随后鉴定出哺乳动物同源物NRAMP2是SINV的受体。NRAMP2是SINV结合和感染所必需的，但在RRV中不是。体外NRAMP2和果蝇中dNRAMP的基因编辑减少了SINV感染，证实了这些蛋白质在体外和体内SINV感染中的作用。 基于CRISPR-Cas9的全基因组筛选的最新研究已能鉴定出几种促进甲病毒感染和发病的宿主受体(图1)。小鼠MXRA8是一种双免疫球蛋白样结构域分子，被鉴定为多种致关节炎性甲病毒(包括CHIKV、MAYV、ONNV、RRV和SFV)的受体，但不适用于脑炎性甲病毒或SINV。MXRA8或其人类直系同源物的缺失可减少致关节炎性甲病毒的感染。在MXRA8和CHIKV间观察到的直接结合被抗MXRA8单克隆抗体(mAbs)、抗CHIKV mAbs或可溶性MXRA8-Fc诱饵分子消除。X射线衍射和冷冻电子显微镜(cryo-EM)研究证实了MXRA8-CHIKV相互作用，并揭示了MXRA8的两个结构域与甲病毒病毒粒子上的E2和E1蛋白的独特结合模式。通过使用MXRA8-Fc诱饵分子和基因编辑小鼠，MXRA8被证明在体内致关节炎性甲病毒感染和疾病发病机制中发挥关键作用。
一项单独的CRISPR-Cas9筛选确定了LDLRAD3是VEEV的受体。LDLRAD3的基因编辑消除了VEEV感染，但不能消除EEEV或WEEV感染。生物物理实验证明了LDLRAD3的结构域1与VEEV p62-E1结构蛋白直接结合。在小鼠中施用LDLRAD3结构域1-Fc诱饵分子或对LDLRAD3进行基因编辑可消除VEEV感染和发病。冷冻电镜研究表明，LDLRAD3与VEEV E2-E1结合的机制类似于CHIKV与MXRA8结合的机制。MXRA8和LDLRAD3都能识别病毒粒子上包含E2(结构域A和B)和E1(结构域II)蛋白残基的相似位点。最近，另一个CRISPR-Cas9筛选确定了另外两种LDL清道夫受体VLDLR和ApoER2，它们促进SFV、EEEV和SINV感染。使用VLDLR-Fc诱饵分子延长了SFV感染小鼠的存活期。 鉴定出NRAMP2、MXRA8、LDLRAD3、VLDLR和ApoER2为甲病毒宿主受体，可以解释甲病毒广泛而不同的宿主嗜性。NRAMP2、VLDLR和ApoER2与SINV、SFV和EEEV的E2-E1蛋白结合方式是否与MXRA8和LDLRAD3与其他甲型病毒的结合方式相似，还需要进行结构研究。了解甲病毒与宿主受体之间相互作用的分子和结构基础有助于鉴定防止甲病毒入侵、感染和发病的单克隆抗体、受体诱饵或小分子抑制剂。
4保护性单克隆抗体
使用单克隆抗体疗法对抗新出现的病毒最近已被证明是一种有前景且可行的SARS-CoV-2预防和治疗策略。对Fc区进行修饰可将mAbs的半衰期延长至约90天。在过去的五十年中，抗体介导的针对甲病毒感染的保护作用已被深入研究。具有中和活性的纯化多克隆抗体或单克隆抗体的被动转移可以保护动物免受甲病毒的攻击。非中和型甲病毒mAbs还可以通过Fc效应器功能和细胞介导的免疫机制赋予动物保护作用。在所有情况下，保护性抗体都以甲病毒异二聚体上的E3、E2和E1蛋白为靶点。
在早期研究中，研究人员用不同的甲病毒感染小鼠，并使用B细胞-骨髓瘤融合和杂交瘤技术产生靶向SFV、SINV、RRV和脑炎性甲病毒结构蛋白的mAbs。体内最具保护作用的mAbs可识别甲病毒E2或E1蛋白上的不同表位。这些开创性研究使用竞争结合试验对甲病毒E2或E1蛋白特异性的mAbs进行分类和鉴定。尽管这些实验为抗体介导的保护如何发生提供了有价值的见解，但本综述重点介绍了最近描述的针对甲病毒结构蛋白的小鼠和人类mAbs(表1)，包括许多具有全面表位定位或结构表征的mAbs、大量的体内保护数据、作用机制数据和甲病毒之间的交叉反应。
表1 本综述中描述的甲病毒单克隆抗体总结。
4.1 E3抗体
E3蛋白参与E2-E1蛋白的转运、稳定和成熟，在释放到细胞外空间时该蛋白与病毒粒子的解离使得E2-E1棘突蛋白在暴露于核内体的酸性环境时启动膜融合。尽管如此，在特定的培养条件下，裂解形式的E3仍可以与某些甲病毒的病毒粒子结合。从接种含有furin切割位点突变(阻止furin加工和随后的E3糖蛋白释放)的重组VEEV菌株的小鼠中分离出一组针对E3蛋白的mAbs。这些mAbs中和了突变株的感染，但不能中和亲代VEEV菌株的感染。有趣的是，在六种抗E3中和mAbs中，mAb 13D4保护小鼠免受亲代VEEV菌株的致命攻击。抗E3单克隆抗体的中和保护机制值得进一步研究。此外，尚未报道针对致关节炎性甲病毒E3蛋白的保护性或中和性mAbs。
4.2 E2抗体
已在E2蛋白的所有三个结构域中鉴定出通过中和人和小鼠抗体识别的表位(图2a–c)。使用经典杂交瘤融合、单抗原特异性B细胞分选或噬菌体展示分离出针对致关节炎性甲病毒(CHIKV、RRV、ONNV、BFV、MAYV、SINV和SFV)和脑炎性甲病毒(EEEV、WEEV和VEEV) E2糖蛋白的中和mAbs。
图2 甲病毒p62-E1异源三聚体上的中和及非中和性单克隆抗体表位。
本综述中描述的甲病毒单克隆抗体(mAbs)的关键氨基酸在基孔肯雅病毒(CHIKV) E2-E1异二聚体(Protein Data Bank ID：6NK5)上高亮显示。采用CHIKV氨基酸编号。
4.2.1结构域AmAbs
一些针对甲病毒E2结构域A的mAbs能够中和感染的发现是基于该区域与宿主细胞受结合的假设。尽管甲病毒中结构域A的氨基酸序列不同(34-93%序列同一性)，但一些研究已经确定了针对不同甲病毒的mAbs，这些mAbs结合在结构域A的相似区域并具有相同的功能特性。尽管如此，大多数中和性和保护性结构域A mAbs具有类型特异性，对异源甲病毒没有交叉反应或交叉保护作用。 在结构域A中，中和性和保护性mAbs主要定位于残基56-81，在较小程度上定位于残基99-121，表明存在暴露的保护性表位(图2a)。本节重点介绍已广泛评估结合表位和保护活性的选定mAbs。在病毒清除后从CHIKV感染小鼠中分离出mAbs CHK-152，并通过抑制病毒融合来有效中和实验室适应型和临床菌株。通过中和逃逸选择，结构域A中的残基59被鉴定为关键相互作用残基，这得到了冷冻电镜研究的证实。在免疫功能正常和免疫功能低下的小鼠中被动转移CHK-152可使其免受CHIKV攻击，减少病毒在恒河猴中的传播和组织损伤。从既往有致关节炎性甲病毒感染史的个体中鉴定出了靶向E2结构域A中相似表位的人mAbs。通过杂交瘤融合或噬菌体展示从CHIKV感染个体中分离出的强效中和mAbs(mAbs IM-CKV063)通过丙氨酸扫描诱变被定位到结构域A残基55-81和99-121上，并可保护小鼠免受CHIKV致病。此外，从既往有RRV感染史的个体中分离出具有重要功能的抗RRV的人mAbs(mAbs RRV-92和RRV-196)，这些mAbs与结构域A内残基60-75结合。两种RRV mAbs(RRV-92和RRV-196)和IM-CKV063分别保护小鼠免受RRV和CHIKV感染。
尽管致关节炎性和脑炎性甲病毒的结构域A序列存在差异，但已鉴定出靶向脑炎性甲病毒相似残基的保护性mAbs。已分离出靶向EEEV E2糖蛋白结构域A的小鼠和人mAbs。通过中和逃逸、诱变和冷冻电镜研究，将三种保护性小鼠mAbs(EEEV-18、EEEV-82和EEEV-102)定位到结构域A中的残基68和结构域B中的氨基酸上。人mAbs EEEV-33保护小鼠免受致死的EEEV气溶胶攻击，并结合结构域A残基34、74和116-120以及结构域B中的一些接触点(残基195-197)。这些mAbs抑制EEEV感染的早期入侵阶段。通过逃逸选择、丙氨酸扫描诱变和结构分析，已将中和性及保护性VEEV mAbs定位到结构域A中的相似残基上。保护性小鼠抗VEEV mAbs(mVEEV-36和mVEEV-68)结合结构域A中跨越残基56-64的表位。这些mAbs抑制VEEV感染的大多数阶段，包括病毒附着在LDLRAD3受体、融合和排出，并保护小鼠免受VEEV感染。总体而言，针对结构域A残基56-81的小鼠和人mAbs的鉴定建立了致关节炎性和脑炎性甲病毒共享的保护性表位。
4.2.2 结构域B mAbs
结构域B是甲病毒E2-E1异二聚体的膜最远端区域，也是中和性和保护性mAbs的另一个靶点(图2b)。结构域B位于融合环上方，可防止融合环过早暴露。类似结构域A，一些研究已经描述了针对结构域B的小鼠和人mAbs，可防止致关节炎性或脑炎性甲病毒感染。致关节炎性甲病毒中结构域B的相对保守序列(CHIKV vs ONNV: 86%)与交叉反应性和交叉保护性mAbs的鉴定相关，这些mAbs分别靶向A-B链中残基180-199和C-C′链中残基209-223的两个表位(图2b)。作用机制研究表明，这些结构域B mAbs可抑制病毒感染的多个阶段，包括病毒附着、融合和排出。
从感染CHIKV的小鼠中分离出小鼠mAb CHK-26585，可中和CHIKV、MAYV、RRV、ONNV和SFV86等多种致关节炎性甲病毒。诱变和冷冻电镜实验表明CHK-265可识别A-B链(残基184、185、190、197和19 9)和C-C′链(残基209、210、211和217)上的残基。从RRV免疫个体中分离出来的RRV-12可有效中和多种致关节炎性甲病毒，并与RRV结构域B残基183-187、218-221和223结合，类似于CHK-265。CHK-265和RRV-12均可抑制病毒复制周期的多个步骤，并保护小鼠免受CHIKV、MAYV和RRV引起的感染和疾病。从接种MAYV的小鼠中分离出交叉反应中和性mAbs。保护性mAb MAY-117与CHK-265和RRV-12具有几乎相同的表位，而诱变研究发现结构域B残基184、185、190和210对结合至关重要。总体而言，重叠结合表位、交叉反应性和治疗性研究表明，一些结构域B结合mAbs(例如CHK-265、RRV-12、DC2.M357和MAY-117)共享一个保守的、广泛中和的和保护性表位。
通过单B细胞分选鉴定出广度更有限的抗致关节炎性甲病毒的交叉反应性mAbs。病毒中和逃逸研究发现结构域B残基209和215对于mAbs DC2.M16和DC2.M108的中和至关重要。这些残基与CHK-265、RRV-12和DC2.M357的结合表位分离。尽管已分离出许多致关节炎性或脑炎性特异性结构域 B mAbs，但交叉反应性似乎需要某些分子决定因素，例如残基184和185的识别。尽管在小鼠和人类中已诱导出对该表位具有广泛反应性的对抗致关节性甲病毒的mAbs，但尚未描述将此类mAbs用于脑炎性甲病毒，可能是由于EEEV、VEEV和WEEV在结构域B中的序列差异较大(31-46%)。
4.2.3 结构域C mAbs
结构域C位于病毒膜的近端，mAbs很难与预融合甲病毒三聚体结合。但已确定针对RRV92和VEEV98结构域C的mAbs可以阻断甲病毒与宿主受体的结合，尽管这些mAbs在结构域A和/或B中有额外的接触(图2c)。在本节中，我们将简要介绍中和结构域C单克隆抗体。 从既往RRV感染的个体中通过丙氨酸扫描诱变发现了两种中和mAbs RRV-210和RRV-221，可识别结构域C中的残基283以及结构域A和B中的残基。这些mAbs阻断MXRA8受体与RRV的结合，从而证明了可能的中和机制。来自接种了VEEV、mVEEV-19和mVEEV-68小鼠的两种中和mAbs也可阻断LDLRAD3受体结合，该受体结合结构域C中残基332。与RRV mAbs类似，VEEV mAbs也与结构域A中的残基结合。mVEEV-68在小鼠中对VEEV具有保护作用，这表明结构域C可能是mAbs的保护性表位。然而，由于这些mAbs识别多个结构域中的残基，这种保护作用有多少来自结构域C仍有待确定。
4.3 E1抗体
虽然E1蛋白的暴露程度与E2蛋白不同，但已报道了对抗SINV和脑炎性甲病毒的具有甲病毒特异性和交叉反应性的E1 mAbs。E1蛋白包括三个结构域(I、II和II)，位于E2蛋白下方(图1)。结构域I位于E1蛋白的中心，位于结构域II和III之间，在成熟的病毒粒子上相对难以接近。结构域III位于病毒膜的近端。迄今为止尚未发现结构域I或III的中和性或保护性mAbs。结构域II内是负责膜融合的疏水融合环，并且已有该结构域的mAbs。虽然大多数E1 mAbs在体外中和活性较差，但有些在体内具有保护作用。与主要通过中和发挥保护作用的E2 mAbs不同，与E1结构域II中近端融合环和融合环内的表位结合(图2d)的mAbs通过抑制病毒形态发生和排出或通过Fc介导的效应机制发挥保护作用。
从感染CHIKV的小鼠中分离到mAb CHK-166，并通过中和逃逸定位到融合环近端的E1结构域II中的残基61上。尽管CHK-166在体外表现出中等的中和活性，但与CHK-152的单价或联合治疗主要通过依赖于单核细胞介导的Fc效应功能的机制保护小鼠免受CHIKV诱导的死亡。其他研究发现，针对E1融合环中残基(例如F95和N100)的低中和性mAbs对致关节炎性和脑炎性甲病毒具有广泛的交叉反应性，并且对小鼠中的多种甲病毒具有保护作用。这些抗原表位在完整的病毒粒子上是不可接近的，这解释了这些mAbs中和活性差的原因。EEEV小鼠mAbs 1A4B-6与多种甲病毒(包括CHIKV、RRV、SINV、SFV、EEEV、VEEV和WEEV)发生交叉反应，可保护小鼠免受致命的VEEV攻击。与先前报道的保护性E1 mAbs一样，随后的丙氨酸扫描诱变实验发现N100是1A4B-6结合的关键E1残基。 其他研究已经确定了针对结构域II类似残基的mAbs，尽管其体内功效或保护机制尚未确定。由经CHIKV免疫个体的外周血构建的噬菌体展示文库中，通过丙氨酸扫描诱变发现五个E1 mAbs在融合环中识别相似的关键残基(例如残基N100)。在CHIKV 6K–E1蛋白免疫的小鼠中建立了一个中和活性较差的mAbs亚群，该亚群对致关节炎性和脑炎性甲病毒具有交叉反应，但尚未评估其保护作用和关键结合残基。 从自然感染和免疫中分离出E1融合环的人和小鼠mAbs，表明甲病毒融合环是一个免疫显性表位。融合环末端的E1残基N100在所有甲病毒中高度保守，是所有广泛保护性E1 mAbs的关键结合残基(图2d)。这类E1 mAbs具有泛甲病毒免疫治疗的潜力，并为泛甲病毒免疫原的开发提供了新的靶点。
5抗体疗法的开发
迄今为止，还没有甲病毒mAb被批准用于人类。但已证明单克隆抗体疗法在预防病毒感染方面具有一定前景，如呼吸道合胞病毒和近期的SARS-CoV-2。用中和mAbs对小鼠和非人灵长类动物(NHPs)进行被动免疫已被证明可以防止甲病毒感染。本节重点介绍了证明甲病毒mAbs在小鼠模型之外具有保护作用的临床前研究，以及利用新型递送平台控制甲病毒感染的研究。
在NHP模型中，mAb单药治疗和联合治疗均显示出对甲病毒感染的治疗效果。
E2 mAb 4N12给药减少了恒河猴中CHIKV诱发的疾病和急性炎症。在一项针对VEEV的NHP研究中，两种抗E2 mAbs (1A3B-7和1A4A-1)的单药治疗可保护动物免受严重VEEV感染的影响，并减少病毒血症。尽管这些mAbs具有保护作用，但NHPs的血清病毒测序显示，在感染后4天内病毒结构域B表位中发生了逃逸突变。为了克服mAbs治疗中病毒的快速逃逸，对联合疗法进行了评估。mAb CHK-152和CHK-166的治疗性给药保护恒河猴免受CHIKV感染和传播。尽管此前的研究在使用单一疗法时在细胞培养物或小鼠中发现了针对CHK-152或CHK-166的病毒逃逸突变，但在接受联合治疗的恒河猴中未发现逃逸突变。因此，针对两个独立mAb表位的联合治疗可能会限制病毒逃逸突变和耐药性的出现。
尽管上述研究利用了动物体内mAbs的被动转移，但该方法存在递送的医学复杂性和治疗成本高昂等局限性。为克服这些限制，最近的一项研究评估了含有编码有效中和CHIKV mAb mRNA的脂质纳米颗粒(LNPs)是否可以预防感染和疾病。给药mAb CHKV-24可保护小鼠免受CHIKV诱导的疾病，并消除病毒血症。当在NHP模型中进行评估时，LNP给药后达到mAbs CHKV-24的保护水平。此外，已在临床试验中评估了CHKV-24 mRNA-LNPs，未产生严重不良反应(NCT03829384)。鉴于基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗的安全性和最近获得的成功，开发mRNA编码的mAbs可能有望用于限制甲病毒感染和疾病。
6甲病毒疫苗
虽然甲病毒疫苗目前尚未批准用于人类，但许多候选疫苗已在动物身上进行了评估，并已进入临床试验阶段。已有多种方法用于生产减毒活疫苗，包括在结构和非结构蛋白中引入减毒突变或缺失、或切除p62 furin裂解位点等。通过对传染性病毒粒子进行化学处理生产灭活病毒疫苗，例如使用福尔马林。病毒样颗粒(VLP)疫苗仅由结构蛋白组成，囊括了病毒粒子的结构特征，但不具有传染性。腺病毒和麻疹载体已被用作甲病毒蛋白免疫原的递送平台。这些病毒载体通常可诱导更有效的CD8 T细胞反应。本节综述的几种候选甲病毒在动物中预防甲病毒感染和疾病，并已进入临床试验阶段(表2)。
表2 处于后期临床开发阶段的甲病毒候选疫苗。
鉴于CHIKV的流行潜力，大多数临床试验都聚焦于针对新兴甲病毒的疫苗。目前正在评估的CHIKV疫苗包括由结构蛋白C-E3-E2-6K-E1(NCT03483961、NCT05072080、NCT02562482和NCT01489358)组成的重组VLPs、表达C-E3-E2-6K-E1结构蛋白的麻疹(NCT03101111、NCT02861586和NCT03807843)和腺病毒载体(NCT03590392)，以及减毒活病毒(NCT04546724和NCT04566484)。一般来说，这些疫苗在早期临床试验中显示出安全性和免疫原性。最先进的候选疫苗之一是VLA1553 CHIKV减毒活疫苗，该疫苗在nsP3复制酶区域有大量缺失。在最近完成的一项III期临床试验中，VLA1553具有良好的安全性和耐受性，并在血清中诱导高水平的中和抗体(NCT04546724)。脑炎性甲病毒因其高死亡率、神经系统后遗症和可能的武器化作用而构成重大威胁，因此评估脑炎甲病毒疫苗的临床试验已经开始。针对EEEV(NCT02654509和NCT00584805)、VEEV(NCT00109304、NCT00582504和NCT00582088)和WEEV(NCT02466750和NCT01159561)的减毒活疫苗试验已经启动，尽管存在反应原性和有限免疫原性的担忧。为了解决这些局限性，根据基于CHIKV VLP的疫苗所采用的策略，生成了由EEEV、VEEV和WEEV结构蛋白组成的复制缺陷型三价VLPs。给NHPs接种三价疫苗可完全预防所有三种脑炎性甲病毒，该疫苗目前正在I期临床试验中进行评估(NCT03879603)。
结语
与致关节炎性和脑炎性甲病毒保护性表位结合的mAbs的鉴定为了解感染或免疫过程中的体液免疫应答、开发mAb治疗策略以及指导迭代疫苗设计提供了机会。疫苗开发面临许多挑战，但了解甲病毒感染期间免疫显性和保护性B细胞表位是推进疫苗开发的重要组成部分。理论上，这些信息可用于通过反向疫苗学将中和mAbs的诱导集中在保护性甲病毒表位上。尽管本综述侧重于将mAbs中和作为主要的保护机制，但在甲病毒疫苗设计过程中应考虑其他免疫相关因素，包括T细胞应答和细胞免疫。迄今为止最先进的甲病毒疫苗临床试验(NCT04546724和NCT03483961)侧重于分析中和抗体反应，虽然未来在评估保护作用的免疫相关性时，分析其他反应将很重要。在抗体保护、受体生物学、抗原性和疫苗开发方面的深入研究使得对抗甲病毒感染的新策略得以发展。这些策略可能为快速制定针对甲病毒感染的对策提供途径，从而限制未来的发病率、死亡率和流行病传播。
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